BLOCK-iT™ 腺病毒 RNAi 表达系统
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Invitrogen™

BLOCK-iT™ 腺病毒 RNAi 表达系统

pAd/BLOCK-iT™-DEST RNAi Gateway™ 载体可用于腺病毒载体体内短发夹 RNA (shRNA) 的高效递送和瞬时表达。一种新型克隆方法使 ∼50-bp DNA了解更多信息
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pAd/BLOCK-iT™-DEST RNAi Gateway™ 载体可用于腺病毒载体体内短发夹 RNA (shRNA) 的高效递送和瞬时表达。一种新型克隆方法使 ∼50-bp DNA 寡核苷酸紧接着 U6 pol III 启动子进入 BLOCK-iT™ U6 入门载体。将入门载体高效重组至 pAd/BLOCK-iT™-DEST 载体,随后进行病毒生产和转导后,U6 启动子驱动的 shRNA 可在大多数分裂或非分裂哺乳动物细胞类型中瞬时表达。产生的 shRNA 可避免宿主防御机制,并将有效地产生 RNAi 基因敲低反应。

pAd/BLOCK-iT™-DEST 载体(图1)提供:

attR 位点环绕的无启动子区域,用于与含有 RNAi 盒的两侧具有 attL 的 U6 Gateway™ 入门载体或任何两侧具有 attL 的启动子和基因序列进行高效重组
• 高效腺病毒包装和目标 shRNA 递送所需的所有组分。利用该载体,可实现分裂和非分裂哺乳动物细胞类型和动物模型中基因敲低的瞬时分析。
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
克隆方法Gateway™
构成或诱导系统组成型
输送类型腺病毒
产品线BLOCK-iT™
产品类型RNAi 表达载体试剂盒
数量20 次反应
RNAi 类型shRNA
载体pAd
促进剂U6
Unit SizeEach
内容与储存
pAd/BLOCK-iT™ RNAi Gateway™ 载体以超螺旋形式提供,浓度为 150 ng/µL,并包括 10 µg 阳性对照载体。BLOCK-iT™ RNAi 腺病毒表达系统包括 BLOCK-iT™ U6 入门载体试剂盒、pAd/BLOCK-iT™-DEST 载体和对照品、293A 细胞系和 LR Clonase™ 酶混合物。将载体储存在 -20°C 下。将细胞系储存于液氮中。将 LR Clonase™ 混合物储存在 -80°C 下。妥善储存时,可保证稳定储存 6 个月。

常见问题解答 (FAQ)

我在使用含EmGFP的表达克隆时,未得到荧光信号。我该怎么办?

请使用推荐的滤波装置对所用荧光进行检测。使用倒置荧光显微镜进行分析。如有需要,可使蛋白表达持续1-3天,再进行荧光检测。

我得到了非特异性、脱靶的基因敲低。我该怎么办?

所用目标序列可能与其他基因具有较高的同源性;请选择一个不同的目标区域。

我在滴定后未得到任何细胞克隆。你们有何建议?

做一个杀死曲线,确定细胞株对抗生素的敏感性。应确保将病毒储液正确保存于-80°C,并且冻融次数不超过3次。最后,使用Polybrene试剂,将重组慢病毒转导至细胞。

我得到了很少的菌落或无菌落,甚至包括转化对照组。可能原因是什么?

应确保所用的感受态细胞被正确保存于-80°C,在冰上融化并立即使用。加入DNA时,轻轻混合感受态细胞:不要使用移液管反复吹打混合。同时,转化所用DNA不要超过最大推荐用量(100 ng),或者DNA加入体积不要超过感受态细胞体积的10%,否则会抑制转化。

我发现当使用BLOCK-iT H1重组质粒或pLenti4/BLOCK-iT-DEST重组体时,在无四环素诱导的情况下,我的目标shRNA有一些本地表达。可能原因是什么?

请确保您使用的含胎牛血清(FBS)的培养基已减少了四环素含量。许多FBS都含有四环素,因为FBS往往是从饮食中含四环素的牛体内分离出来的,这导致出现低水平的shRNA本底表达。应确保使用可表达Tet阻遏蛋白的细胞系,并以合适的MOI进行转导。如果您自行建立了可表达Tet阻遏蛋白的细胞系,则应在使用shRNA重组体转导细胞前至少等待24小时。