Flp-In™ 完整系统

我们在内部实验中发现，当FRT位点整合进入具有高度转录活性的宿主细胞基因组位点中时（在Flp-In CHO与Flp-In 293细胞中更为常见，但也出现于Flp-In 3T3细胞及其他任何Flp-In宿主细胞系中），就会出现一些“读通（read-though）”的转录现象，并在Flp-In反应后翻译出lacZ-Zeocin ORF——即使lacZ-Zeocin ORF未包含真正的启动子和ATG起始密码子。在这一情况发生时，潮霉素抗性克隆就可能同时出现lacZ阳性和Zeocin抗生素耐受性。为了确保FRT实现了位点特异性整合而非随机整合，我们推荐用户在无pOG44存在的条件下开展平行的对照转染实验。这一对照组在潮霉素筛选过程中应不存在存活的克隆，表明在pOG44存在条件下获得的所有潮霉素抗性克隆确实为Flp重组酶依赖克隆，因此确定目的基因确实有效整合进入了FRT位点。另外，针对这些克隆进行Southern杂交分析也能够帮助用户验证目的基因确实发生了准确的FRT整合，尽管lacZ也出现表达（尽管通常情况下这是不必要的）。在Flp-In反应之后，一旦您观察到潮霉素耐受克隆，我们就推荐您将其挑选出来，并分析其中的目的基因表达情况。

Flp-In 3T3细胞系源自于NIH3T3细胞，后者是小鼠的成纤维细胞。CMV启动子在小鼠细胞系中已知会随时间延长而逐渐沉默，因此我们推荐您在这类细胞系中使用那些包含非CMV型启动子的Flp-In表达载体，如pEF5/FRT/V5-D-TOPO载体或pEF5/FRT/V5-DEST载体。

在放弃之前，我们推荐您尝试使用pFRT/lacZeo2载体来建立您的宿主细胞系。这一载体包含了截短型的SV40启动子的，它驱动了lacZ-Zeocin融合蛋白的表达。使用这一载体能够帮助用户分离出那些整合在增强子附近的克隆，从而获得更高的目的基因表达效果。

Jump-In系统是由PhiC31-整合酶所介导的一个不可逆转的哺乳动物稳定定向表达系统。这一系统是由Jump-In Fast系统和Jump-In TI（定向整合）系统所组成，前者包含了单一的整合步骤，后者则需要两个整合步骤，两者都是定向且不可逆的。相比而言，Flp-In系统是一款可逆和稳定的哺乳动物靶向表达系统。第一步整合是随机的（pFRT/lacZeo的整合），而第二步整合（Flp-In表达载体的整合）是定向但可逆的。

在理论上来讲，用户能够实现Flp-In表达载体的多重整合效果——这其中包含了一个FRT-特异性的整合事件和一个随机的第二位点整合事件。不过，随机整合的发生概率相对较低。转染过程中所用DNA的有限数量将减少第二位点的整合概率。我们向293细胞（缺少FRT位点）中转染了pcDNA5/FRT载体，并在筛选了200个以上的克隆后，鉴定到一个潜在的第二整合位点。用户可通过Southern杂交来检测DNA的整合位点。单一整合元件会显示为独立的一个条带；两个整合位点：两个条带；三个位点，三条带，如此延续。我们将一些Flp-In表达细胞系培养了四个月以上，无论是否向培养体系中加入潮霉素，均未发现Flp-In表达载体发生任何形式的丢失。