测序用 GeneRacer™ 试剂盒（含 SuperScript™ III RT）和 Zero Blunt™ TOPO™ PCR 克隆试剂盒

请看下面的原因和建议：

-基因组DNA污染或者存在未知的剪切体： 采用扩增级DNase I（货号18068015）预处理RNA。设计退火到内含子两侧的外显子序列的引物，或者退火到mRNA的外显子/外显子边界处的序列的引物，以便区分扩增的cDNA和潜在的污染物基因组DNA。如需检测产物是否来自于DNA，设置一组不进行反转录的RNA对照组进行PCR。
-引物非特异性退火： 改变PCR的退火条件。使用热启动PCR聚合酶。针对各种模板和引物组合优化镁离子浓度。
-引物形成二聚体： 设计3′ 端不含互补序列的引物。

以下列出了各种原因和我们提供的建议：

-第一链cDNA合成过程中出错：请采用优质RNA作为对照，验证第一链反应的效率。
-存在RNase污染： 向样品中添加对照RNA，以判定在第一链反应体系中是否存在RNase。您可在第一链反应体系中使用RNase抑制剂。
-RNA出现多糖共沉淀： 采用氯化锂沉淀RNA，以便去除多糖，详见Sambrook等人所述。
-靶标mRNA含有较强的转录停顿因子： 在第一链合成中，使用随机六聚体引物替代oligo(dT)，提高温度，使用靠近靶标cDNA 3′末端的PCR引物。
-PCR使用的第一链产物过少： 在50 mL PCR反应之中，至多可使用10%的第一链反应产物
-第一链合成时使用了基因特异性引物： 可以试试其他的基因特异性引物，或者改用 oligo(dT)。请确保GSP为反义序列。
-存在反转录酶抑制剂： 可在第一链反应之前，通过对mRNA进行乙醇沉淀来去除抑制剂。可以使用70%（体积比）乙醇洗涤mRNA沉淀。注：反转录酶抑制剂包括SDS、EDAT、胍盐、甲酰胺、焦磷酸钠和亚精胺。 -RNA已降解： 确认使用高质量和完整的RNA。
-退火温度过高： 视必要降低温度和/或使用降落PCR。

3′端RACE利用了mRNA中自带的poly(A)尾作为通用的PCR反应的起始位点。在这一操作步骤中，mRNA通过反转录酶(RT)和oligo-dT接头引物反转录成cDNA。特异性的cDNA随后通过PCR反应，采用基因特异性引物（GSP，退火到已知外显子序列的区域）和接头引物（靶向poly(A)尾区域）进行扩增。这样一来，即可捕获处于外显子和poly(A)尾之间的未知的3′-mRNA序列。

以下为几条有助于您优化自己的RACE反应的建议：

•使用优质完整的RNA
•使用目标基因高表达丰度的RNA样品
•各个步骤上样量不要超过建议的量
•针对PCR反应优化退火温度
•加入推荐的对照

可变剪接或可变polyA位点以及可变的起始位点都会产生正常的多个条带。进行测序有助于帮助您解决不确定性问题。