HiMark™ 预染蛋白标准品

褪色最可能是由于封闭/洗涤液中的洗涤剂将一些蛋白质从膜上洗脱造成的。染料本身不会从蛋白质上洗脱，因为它们是共价结合的。我们已经发现较小孔径的膜可以在封闭和洗涤过程中更好地保留蛋白质，因此，为了获得绝佳的分辨率和蛋白质保留率，推荐使用0.2 µm代替0.45 µm的膜。转印后，可以用铅笔在膜上圈出预染条带，从而在封闭和处理后仍可辨认条带位置。

•降低电压、电流或缩短转印时间
•确保转膜缓冲液的甲醇浓度合适；可使用浓度为10–20%的甲醇，从而去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，并促进蛋白质与膜的结合。
•确保转膜缓冲液的SDS浓度合适（若加入了SDS），SDS浓度不要超过0.02–0.04%。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。过多的SDS会阻碍蛋白质与膜的结合。
•检查膜的孔径和靶标蛋白质的大小。小于10kDa的蛋白质很容易穿过0.45μm孔径的膜。如果您的目标蛋白质小于10 kDa，那么最好使用0.2μm孔径的膜。

•增加电压、电流或转印时间
•凝胶和SDS-蛋白质复合物中的SDS会促进蛋白质从凝胶中洗脱，但抑制蛋白质与膜的结合。这种抑制作用在硝化纤维素膜上的强度大于PVDF膜。对于难以从凝胶中洗脱的蛋白质，如大分子量蛋白质，可在转膜缓冲液中加入少量SDS以改善转印效果。我们建议在组装三明治前将凝胶置于含0.02–0.04% SDS的2x转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含10%甲醇和0.01% SDS的1X转膜缓冲液进行转印。
•甲醇可去除SDS-蛋白质复合物中的SDS，促进蛋白质与膜的结合，但对凝胶本身有一些不良影响，会降低转印效率。甲醇可能导致孔径减小、某些蛋白质发生沉淀以及一些碱性蛋白质带正电荷或变为中性。应确保转膜缓冲液的甲醇浓度不高于10–20%，并使用高质量的分析级甲醇。

预染标准品具有与每种蛋白质共价结合的染料，这将导致标准品在不同的缓冲系统（即不同的凝胶）中迁移率不同。因此，使用预染标准品进行分子量估算将仅得出蛋白质的表观分子量。预染标准品可用于分子量估算、确认凝胶迁移和估算转膜效率，但对于需要精确估算分子量的应用，应使用非预染标准品。

•上样时，请注意确保相邻样品泳道没有交叉污染。
•确保每个泳道上标准品的量都是正确的。蛋白质上样过多会导致产生额外的条带，这个问题在使用银染凝胶时尤为突出。
•标准品储存不当或反复冻融会导致蛋白质降解。