Stealth RNAi™ siRNA 荧光素酶报告基因对照

载体介导的技术使您能够：

•实现瞬时或稳定的靶点敲低
•在所有细胞类型中实现RNAi，甚至是难转染、原代和不分裂细胞
•通过siRNA的诱导表达，调控基因抑制效应
•可以筛选稳定表达某个siRNA序列的单一细胞群
•利用组织特异性启动子控制体内基因表达

我们建议进行一个转染试剂对照实验，确定您的细胞是否对转染试剂敏感。此外，您可以尝试其他细胞密度和siRNA浓度以减少转染本身的毒性。

在一些情况下，即使mRNA已经被敲低，蛋白的敲低效果也会受蛋白降解速率等其他变量的影响。另外，相比于mRNA，蛋白可能需要更长的时间才能看到敲低效果。

请参考以下可能的原因和建议：

•您测试了多少个siRNA？有任何敲低效果吗？如果所有siRNA都没有敲低效果（<10%），那么可能是检测方法本身的问题。试试使用其他qRT-PCR assay评估敲低效果。
•qRT-PCRassay的靶位点和siRNA切割位点的相对位置如何？如果两者相差3,000碱基以上，问题可能是其它剪接转录本的存在造成的。
•实验的Ct值是多少？在40循环的qRT-PCR实验中它们应该低于35。
•您确定siRNA转染进入细胞中了吗？我们建议使用一个经过验证的阳性对照siRNA来检查转染效率。

请参考以下可能的原因和建议：

•是检测的mRNA水平吗？最可靠的方法是实时PCR。在一些情况下，即使mRNA已经被敲低，蛋白的敲低效果也可能会受蛋白降解速率等其它变量的影响。
•RNA是如何提取的？检测提取的RNA的质量了吗？应确保RNA没有降解。
•使用阳性对照了吗？这可以帮助确定试剂是否有效以及siRNA是否被正确递送进细胞。请在进行实验的同时使用阳性对照siRNA。
•使用转染对照了吗？被转染细胞的百分比是多少？
•进行不同时间的检测了吗？通常，基因沉默可以早在转染后24小时测定。但是，基因敲低的持续时间和程度取决于所用的细胞类型和siRNA的浓度。
•优化过转染条件吗？您可以尝试使用不同的细胞密度和siRNA浓度。
•您使用了多大浓度的siRNA？我们建议测试 5 nM到100 nM之间的多个浓度。