Bac-to-Bac™ C-His TOPO™ 表达系统
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Bac-to-Bac™ C-His TOPO™ 表达系统

Bac-to-Bac baculovirus expression is an efficient method for producing baculovirus for high-level protein expression in insect cells. It relies on了解更多信息
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Bac-to-Bac baculovirus expression is an efficient method for producing baculovirus for high-level protein expression in insect cells. It relies on generation of recombinant virus by site-specific transposition in E. coli rather than homologous recombination in insect cells. The pFastBac C-His TOPO expression system features:

Flexibility—The Bac-to-Bac C-His TOPO vector contains a C-terminal His-tag with a TEV cleavage site for easy purification of His- tagged proteins with nickel-chelating resins (such as the Invitrogen ProBond Purification System) and generation of native proteins with the aid of the Invitrogen AcTEV Protease.

Fast cloning, easy screening—Blunt TOPO cloning technology enables cloning of blunt-end PCR products into the pFastBac TOPO vector in five minutes. In addition, the pFastBac TOPO expression kit is supplied with Mach1-T1R E. coli that enable the visualization of colonies eight hours after plating on ampicillin-selective plates due to their faster doubling time compared to other standard cloning strains. Find out more about the advantages of TOPO cloning ›

High transfection efficiency with ExpiFectamine Sf Transfection Reagent—The Bac-to-Bac TOPO expression kits now come with the next-generation ExpiFectamine Sf Transfection Reagent for efficient DNA transfection in insect cells using fast, flexible protocols. Find out more about this reagent ›

Time-saving expression bacmid—With the Bac-to-Bac system, the expression cassette of the pFastBac vector recombines with the parent bacmid in DH10Bac E. coli Competent Cells to form an expression bacmid. The bacmid is then transfected into insect cells for production of recombinant baculovirus particles.

Easy colony screening—The parent bacmid in DH10Bac E. coli contains a segment of the lacZa gene. The lacZa gene is disrupted upon transposition of the expression cassette into the bacmid, allowing for blue/white selection of recombinants for easier identification of recombinant colonies.

High protein expression—The pFastBac vector uses the strong polyhedrin promoter to generate high levels of expression in a variety of insect cell line such as Sf9, Sf21, and High Five cells.

仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
耐抗生素细菌氨苄青霉素 (AmpR)、庆大霉素 (GmR)
克隆方法Blunt TOPO™
表达机制基于细胞的表达
产品规格液体
产品线Bac-to-Bac、TOPO
蛋白标记His 标签 (6x)
数量20 次反应
表达系统杆状病毒
促进剂多角体蛋白
类型表达系统
Unit SizeEach
内容与储存
Bac-to-Bac C-His TOPO 表达试剂盒:
• 用于 20 次 TOPO 克隆反应的载体试剂盒,在 -20°C 下储存
   – pFastBac/CT-TOPO 载体含有 C 端 TEV 切割位点和 His 标签
   –pFastBac 1-Gus 对照质粒(对照表达载体)
   – 其他试剂盒试剂:10X PCR、dNTP 混合物、盐溶液、无菌水、对照 PCR 模板、多角体蛋白正向引物、SV40 pA 反向引物
•用于 20 次反应的 One Shot Mach1-T1R 化学感受态大肠杆菌 (20 x 50 µL),在 -80°C 下储存
•用于 20 次反应的 MAX Efficiency DH10Bac 感受态大肠杆菌(4 个试剂盒,每个试剂盒 5 x 0.1 mL),在 -80°C 下储存
•ExpiFectamine Sf 转染试剂 (1 mL),在 4°C 下储存,切勿冷冻

常见问题解答 (FAQ)

使用BaculoDirect表达试剂盒后,无法检测到任何重组融合蛋白。可能原因是什么?你们有何建议?

请检验入门克隆的构建,应确保插入片段位于载体读码框内。在LR反应后,利用PCR法分析重组病毒DNA,确认插入片段的大小和方向均正确。对PCR产物进行测序,确认用于表位标签表达的读码框正确。

我的P1病毒储液滴度较低,如何能够生成高滴度储液?

为得到高滴度储液,应使用P1储液再次感染细胞并生成P2高滴度储液。按照BaculoDirect使用手册第18页的说明,生成P2储液。

我进行了LR反应,并随后转染到Sf9/Sf21昆虫细胞中,但即使72小时后仍未观察到任何感染迹象。我该怎么办?

请查看以下建议:

•在转染到昆虫细胞中之前,利用PCR分析检验LR反应。
•在转染实验中,我们建议使用无添加的Grace’s昆虫细胞培养基代替无血清培养基,因为无血清培养基中的有些成分可能干扰转染。
•转染期间,应保证无FBS、无添加剂、无抗生素,因为这些物质中的蛋白质会干扰Cellfectin II试剂。
•LR重组反应中,以pENTR/CAT质粒为阳性对照,以Cellfectin II试剂(模拟转染)作为阴性对照。
•确保细胞处于对数生长期,存活率高于95%,细胞使用量应与使用手册的建议一致。
•若转染效率较低,细胞可能需要1周时间才能出现病毒感染迹象;继续培养,同时每日观察细胞的感染迹象。

更昔洛韦溶液中出现沉淀。我该怎么办?

在37°C水浴中温浴更昔洛韦5-10分钟,然后涡旋数分钟。沉淀应该重新溶解于溶液中。

我在使用His标签纯化柱对在昆虫细胞中表达的分泌型蛋白进行纯化时,未得到蛋白。为什么?我该怎么办?

用于培养昆虫细胞的培养基通常具有酸性pH(6.0-6.5)或含有电子供应基团,可阻止6xHis标签蛋白与Ni-NTA发生结合。昆虫细胞生长培养基所含谷氨酰胺、甘氨酸或组氨酸等氨基酸的浓度显著高于哺乳细胞生长培养基,这些氨基酸可与6xHis标签蛋白竞争Ni-NTA基质上的结合位点。例如,Grace’s培养基(Life Technologies)含有约10 mM谷氨酰胺、10 mM甘氨酸和15 mM组氨酸。

使用含适当成分和pH(8.0)的缓冲液对培养基进行透析,透析用缓冲液与在天然条件下进行纯化所使用的推荐裂解缓冲液相似,通常可恢复最佳的结合条件。应注意,选用的培养基可能导致出现白色沉淀(可能由不溶性盐组成),但6xHis标签蛋白通常留在溶液中。使用无蛋白质的培养基时,可通过蛋白质定量进行检测;或者利用免疫印迹分析法检测6xHis标签蛋白的含量。离心后,可从清澈的上清液中直接纯化6xHis标签蛋白。