PichiaPink™ 分泌性蛋白试剂盒
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Invitrogen™

PichiaPink™ 分泌性蛋白试剂盒

PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒是一种基于酵母菌毕赤酵母的重组蛋白表达系统。PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒可为您提供从摇瓶至 1000 升重组蛋白生产的方便且经济高效的生物生产。PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒随附我们的新毕赤酵母菌株、pPINK-HC了解更多信息
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货号 A11151
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PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒是一种基于酵母菌毕赤酵母的重组蛋白表达系统。PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒可为您提供从摇瓶至 1000 升重组蛋白生产的方便且经济高效的生物生产。PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒随附我们的新毕赤酵母菌株、pPINK-HC 和 pPINK-LC 载体以及用于生产蛋白质的分泌信号序列。
 以毕赤酵母中分泌性蛋白生产开始。
• 通过营养缺陷型和颜色选择快速筛选毕赤酵母转化体。
• 使用蛋白酶缺乏的毕赤酵母菌株减少蛋白降解。

PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒随附:
• PichiaPink™ 分泌性蛋白载体试剂盒(货号 A11153
• PichiaPink™ 表达菌株套件(货号 A11154
• PichiaPink™ 培养基试剂盒(货号 A11156

筛选毕赤酵母转化体的新方法
PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒使用腺嘌呤营养缺陷型来选择毕赤酵母转化体。PichiaPink™ 菌株具有 ade2 基因型,需要与 ADE2 基因互补才能在无腺嘌呤的情况下生长。使用营养缺陷型标志物还可以更容易地维持转化体。无需使用抗生素来维持您的转化体。

此外,您可以按颜色筛选毕赤酵母转化体。未转化的 PichiaPink™ 菌株表现为粉红色菌落,而转化的 PichiaPink™ 菌株表现为白色菌落(图 1)。

使用 pPINKα-HC 载体分泌您的蛋白

PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒随附 pPINKα-HC 载体。pPINKα-HC 载体具有内置的 α-交配因子信号序列,可使您的蛋白分泌到培养基中。将您的蛋白质分泌到培养基中可以更容易收获和纯化您的蛋白。pPINKα-HC 载体围绕 ADE2 基因构建,以补充 ade2 缺陷型毕赤酵母菌株。该载体使用甲醇诱导的 AOX1 启动子来表达您的蛋白。此外,pPINKα-HC 载体设计用于在毕赤酵母转化体中以高拷贝数进行整合。

PichiaPink ™ 分泌性蛋白载体试剂盒(货号 A11153)可单独订购以补充 PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒。

使您的蛋白保持完整
PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒随附 PichiaPink™ 表达菌株套件。该套件包含与 PichiaPink™ 酵母表达系统配合使用的 4 株毕赤酵母菌株。所有 4 株菌株均为 ade2 基因型。此外,3 株菌株包括 2 个蛋白酶基因的敲除。蛋白酶缺乏菌株可减少细胞培养时对蛋白酶抑制剂的需求,并可提高蛋白产量。检测单蛋白酶敲除或双蛋白酶敲除,找出比较适合您的蛋白酶。

您可以单独订购 PichiaPink™ 表达菌株套件(货号 A11154)以补充 PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒。

袋装培养基方便您开始使用

PichiaPink™ 培养基试剂盒是一组方便的预包装培养基袋,可与 PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒配合使用。PichiaPink™ 培养基试剂盒含有将 PichiaPink™ 菌株从冷冻储备生长至可进行转化和选择的培养物所需的培养基。您可以单独订购 PichiaPink™ 培养基试剂盒(货号 A11156)以补充 PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒。

为什么选择 PichiaPink™ 酵母表达系统?
PichiaPink™ 酵母表达系统基于酵母菌毕赤酵母毕赤酵母的优点包括快速生长、明确的遗传背景、简单的培养基配方和易于处理。30 多年来,毕赤酵母已经被全球实验室用于生产来自多个物种(包括人类)的数百种不同蛋白(参考文献 1、2)。PichiaPink™ 酵母菌表达系统使您能够以便利且具成本效益的方式实现从小规模到大规模的蛋白质生产。

有关获取 PichiaPink™ 酵母菌表达系统商业用途许可证的信息,请访问outlicensing@lifetech.com

仅供研究使用。不适用于任何动物或人的治疗或诊断。

相关链接
请参阅了解更多有关 PichiaPink™ 酵母表达系统的信息
了解更多有关其他蛋白表达系统的信息

参考文献

1.Cereghino JL, Cregg JM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.FEMS Microbiol Rev. 2000 Jan;24(1):45-66.[PubMed]
2.Cereghino GP, Cereghino JL, Ilgen C, Cregg JM.Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.Curr Opin Biotechnol.2002 Aug;13(4):329-32.[PubMed]
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
适用细胞毕赤酵母菌株
表达机制基于细胞的表达
表达稳定性稳定
最终产品类型液体培养基、琼脂平板
产品线PichiaPink
数量1 kit
运输条件室温
种属毕赤酵母
表达系统酵母
类型分泌性蛋白试剂盒
Unit SizeEach
内容与储存
PichiaPink™ 分泌性蛋白表达试剂盒包括:
•含有高拷贝数质粒和酿酒酵母 α 交配因子前序列的 PichiaPink™ 分泌性蛋白载体试剂盒,可产生分泌性蛋白表达。
•含 4 种甘油菌株的 PichiaPink™ 表达菌株套件
•含 4 种碱性培养基的 PichiaPink™ 培养基试剂盒。

常见问题解答 (FAQ)

当使用pPIC6/pPIC6α载体在X-33酵母株中筛选杀稻瘟菌素抗性转化株时,为什么在含300 μg/ml杀稻瘟菌素的YPD培养皿中得到的菌落有大有小?

通常,大菌落代表含pPIC6/pPIC6α整合体的转化株,而小菌落代表含pPIC6/pPIC6α非整合体的转化株。这些非整合体转化株已经转导了pPIC6/pPIC6α质粒,因此,在起始筛选过程中表现出低水平的杀稻瘟菌素抗性。在后续筛选中,这些非整合体转化株不会保持杀稻瘟菌素抗性。

当您为表达实验选择杀稻瘟菌素抗性转化株时,我们建议您从起始转化培养皿中挑选杀稻瘟菌素抗性菌落,然后在第二个含有适当浓度杀稻瘟菌素的YPD培养皿中划线。应选择可保持杀稻瘟菌素抗性的转化株用于下一步研究。

我的转化失败了。你们有何建议?

•应确保收集的是处于对数生长期的细胞(通常OD <1.0)。
•如果使用电穿孔法,应查看电穿孔仪使用手册中的推荐条件。可根据需要,改变电穿孔参数。
•使用更多的DNA。
•使用新鲜配制的感受态细胞。
•如果使用LiCl转化法,可尝试煮沸载体DNA。

我成功制备了两次Pichia的原生质球,之后就制备不成功了。培养物的OD值根本不降低。

应考虑以下几点:

1.如果所用细胞的OD值过高,则它们不能形成原生质球。不要使细胞过度生长。
2.不要使用衰老的细胞,应确保细胞处于对数生长期。
3.使用前,将酵母裂解酶混合均匀。酵母裂解酶更大程度上是一种悬液,而非溶液。
4.每次都使用新鲜配制的PEG溶液,并检查pH。

使用组成型表达载体(如pGAPZ)进行发酵,是否有推荐的实验方案?

pGAP克隆可使用以下高细胞密度实验方案。加入碳料,直至达到所需的细胞密度(细胞湿重(WCW)为300-400 克/升)。如果发酵罐中的蛋白状态良好,可增加至300–400 克/升 WCW,与甲醇诱导型克隆相似。在发酵后48小时内,可达到该密度。我们已经使用这些方案,使组成型表达载体在甘油中进行发酵,并得到良好的结果。您可能需要对发酵基础盐培养基做以下改进:

1) 在分批发酵培养基中,用2%葡聚糖代替4%甘油。
2) 在补料生长培养基中,用40%葡聚糖代替50%甘油。
3) 以12 毫升/升/小时的速度补加40%葡聚糖(Jim Cregg已经发表使用多种碳源作为底物进行表达的数据;葡聚糖带来最高表达水平)。
4) 可在培养基中加入酵母提取物和蛋白胨,维持蛋白稳定性。

警告:如果您在使用His-酵母株,使用pGAPZ转化后,酵母株依然是His-标记的。使用基本培养基发酵时,需要在发酵罐中加入组氨酸。

用于制备Pichia发酵培养基的甲醇和氢氧化铵溶液能否进行高压灭菌?

不能,您不能对甲醇进行高压灭菌。有两种方法可解决该问题,一定程度上取决于生物反应器的大小和使用体积。您可将甲醇稀释到工作浓度,并用适用于乙醇的过滤器进行过滤除菌,或者您可以假设甲醇是无菌的(本应该是无菌的)并将其直接稀释到无菌水中。氢氧化铵溶液也不可以进行高压灭菌。您可以假设30%储液是无菌的(没有生物能在该溶液中存活),并使用无菌水将其稀释至工作浓度。