PichiaPink™ 表达菌株集

通常，大菌落代表含pPIC6/pPIC6α整合体的转化株，而小菌落代表含pPIC6/pPIC6α非整合体的转化株。这些非整合体转化株已经转导了pPIC6/pPIC6α质粒，因此，在起始筛选过程中表现出低水平的杀稻瘟菌素抗性。在后续筛选中，这些非整合体转化株不会保持杀稻瘟菌素抗性。

当您为表达实验选择杀稻瘟菌素抗性转化株时，我们建议您从起始转化培养皿中挑选杀稻瘟菌素抗性菌落，然后在第二个含有适当浓度杀稻瘟菌素的YPD培养皿中划线。应选择可保持杀稻瘟菌素抗性的转化株用于下一步研究。

•应确保收集的是处于对数生长期的细胞（通常OD <1.0）。
•如果使用电穿孔法，应查看电穿孔仪使用手册中的推荐条件。可根据需要，改变电穿孔参数。
•使用更多的DNA。
•使用新鲜配制的感受态细胞。
•如果使用LiCl转化法，可尝试煮沸载体DNA。

应考虑以下几点：

1.如果所用细胞的OD值过高，则它们不能形成原生质球。不要使细胞过度生长。
2.不要使用衰老的细胞，应确保细胞处于对数生长期。
3.使用前，将酵母裂解酶混合均匀。酵母裂解酶更大程度上是一种悬液，而非溶液。
4.每次都使用新鲜配制的PEG溶液，并检查pH。

pGAP克隆可使用以下高细胞密度实验方案。加入碳料，直至达到所需的细胞密度（细胞湿重（WCW）为300-400 克/升）。如果发酵罐中的蛋白状态良好，可增加至300–400 克/升 WCW，与甲醇诱导型克隆相似。在发酵后48小时内，可达到该密度。我们已经使用这些方案，使组成型表达载体在甘油中进行发酵，并得到良好的结果。您可能需要对发酵基础盐培养基做以下改进：

1) 在分批发酵培养基中，用2%葡聚糖代替4%甘油。
2) 在补料生长培养基中，用40%葡聚糖代替50%甘油。
3) 以12 毫升/升/小时的速度补加40%葡聚糖（Jim Cregg已经发表使用多种碳源作为底物进行表达的数据；葡聚糖带来最高表达水平）。
4) 可在培养基中加入酵母提取物和蛋白胨，维持蛋白稳定性。

警告：如果您在使用His-酵母株，使用pGAPZ转化后，酵母株依然是His-标记的。使用基本培养基发酵时，需要在发酵罐中加入组氨酸。

不能，您不能对甲醇进行高压灭菌。有两种方法可解决该问题，一定程度上取决于生物反应器的大小和使用体积。您可将甲醇稀释到工作浓度，并用适用于乙醇的过滤器进行过滤除菌，或者您可以假设甲醇是无菌的（本应该是无菌的）并将其直接稀释到无菌水中。氢氧化铵溶液也不可以进行高压灭菌。您可以假设30%储液是无菌的（没有生物能在该溶液中存活），并使用无菌水将其稀释至工作浓度。