GeneArt™ pYES1L Vector with Sapphire™ Technology

我们建议将克隆重新接种到新的平板上并再次进行菌落PCR。不要使用试剂盒提供的微珠破坏酵母细胞，那些微珠是用于进行E. coli 转化的。另外，在50 uL PCR反应中使用不超过0.5微升稀释后的酵母裂解物。

确保您的酵母转化在30摄氏度下孵育3天，以获得合适大小的克隆。

请参考以下建议：

•完全按照实验步骤要求进行转化。
•不要冻融或漩涡混匀MaV203酵母感受态细胞。
•使用CSM-Trp琼脂平板进行转化。
•要获得最佳结果，请使用新开瓶的DMSO。您也可以使用保存在-20摄氏度下的DMSO。

可以，您可以根据下列建议用GeneArt High-Order载体转换元件（货号A13291）将您的E. coli载体改造为酵母兼容的克隆载体用于 GeneArt High-Order遗传组装系统：

•使用DNA Oligo Designer在线工具，确认您的载体和GeneArt High-Order载体转换元件没有内部同源序列以避免在GeneArt High-Order遗传重组系统内使用您的改造载体时出现可能的重排。
•如果最终质粒要被转移到E. coli中的话，对于1个大于15 kb的最终质粒，请使用一个带有单拷贝或低拷贝复制起始点的载体。通常，低拷贝质粒的效能显著大于高拷贝质粒。
•避免在自己的载体上使用氯霉素抗性，因为转换元件是氯霉素抗性。
•在连接后（建议使用1:10的载体：插入片段比），使用连接混合物转化E. coli细胞并涂板于双抗性LB平板上（氯霉素加用户载体上的抗生素标记）。要线性化酵母兼容的克隆载体用于多片段组装，需要进行一次双酶切以避免单酶切后产生的回文序列造成的背景。

用于插入编辑的stitching寡核苷酸除了插入碱基之外必须含有和每个相邻片段重叠的30bp核酸序列（最大长度80 mer，包括20 mer的插入碱基）。请参见用户手册内的图表。注意：这适用于2片段组装和插入仅适用于内部连接。对于其他的无缝连接，请使用40 bp重叠序列（即一个80 mer的寡核苷酸）。

用于删除编辑的stitching寡核苷酸必须含有和每个相邻片段重叠的40bp核酸序列，重叠区域可以离开片段连接处6个核苷酸处开始匹配，从而在每个片段末端有6 bp的序列可以在转化介导的重组中被删除。请参见用户手册内的图表。注意：这适用于2片段组装和删除仅适用于内部连接。对于其他的无缝连接，请使用40 bp重叠序列（即一个80 mer的寡核苷酸）。