Alexa Fluor™ 488 寡核苷酸胺标记试剂盒

没有充分去除游离染料可能造成高背景。尝试使用HPLC或凝胶电泳纯化寡核苷酸确保去除没有反应的染料。

以下是一些可能的原因及我们的建议：

•检查Alexa Fluor氨基反应染料的生产日期及其储存条件。染料对水敏感，如果暴露在潮湿的环境或者水中，将可能会失去活性。它们应该以粉末形式保存，并保持干燥防水。应该使用无水DMSO溶解染料，并且一旦将染料溶于DMSO，需要立刻使用，因为溶解后染料会对水分更加敏感也会更加不稳定。活性染料同样也需要避光保存。以粉末形式保存于干燥避光条件下时，染料至少可以在六个月内保持稳定；超过此保存时间的染料可能会水解并不再具有反应活性。
•有一些反应需要较高的染料：寡核苷酸摩尔比，因此在反应中你可能需要使用更多的染料或者更少的寡核苷酸。
•标记反应在微碱性的pH下效果最好，此时寡核苷酸的氨基去质子化，因此在反应中应该使用0.1M硼酸钠，pH 8.5的标记缓冲液。为获得最佳效果，不应使用其它缓冲液，因为pH值可能不合适，或者有可能含有干扰反应的组分。
•确保反应中没有蛋白质或伯胺。反应前，应将氨基修饰的寡核苷酸进行提取及纯化以去除各种胺，如Tris，三乙胺，铵盐，甘氨酸，牛血清白蛋白，或其它含胺的分子，因为它们会与氨基反应性染料相互作用而降低其反应效率。
•检查检测所用的荧光滤光片，确保其与染料相兼容。你也可以在所用滤光片下检测一小滴没有稀释的染料，确保在与寡核苷酸结合前你能对单独的染料本身成像。Alexa Fluor 647的发射荧光是肉眼不可见的，因此需要远红外成像系统进行检测。

氨基修饰的寡核苷酸可以从提供定制寡核苷酸服务的商家获得。想了解更多关于我们的DNA寡核苷酸定制服务的信息，请点击这里(http://www.thermofishermall.com/)。

我们建议使用凝胶电泳或在乙醇沉淀后使用逆相HPLC。更多关于纯化步骤的细节请参阅产品手册：Alexa Fluor 寡核苷酸胺基标记试剂盒产品手册(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp20191.pdf)

每管中精确的氨基反应性染料的量是保密的；但是，每管提供的染料量最适于标记50ug 长度在18至24碱基的5’-氨基修饰的寡核苷酸。试剂盒包含3管染料，总共可用于3次反应。氨基反应性Alexa Fluor染料也可以作为单独试剂购买，试剂规格从100 µg至25 mg不等。