钙黄绿素 AM，细胞可透过性染料

一种可能性是染料之间的光谱渗漏。务必通过在绿光下成像红色细胞，在红光下成像绿色细胞的方式检查单色样品，对其他颜色使用最佳成像设置。如果您在对照中看到这些渗漏，那么就需要减少染料标记浓度以降低染料的亮度，或者选择那些光谱相距较远的染料。如果不是渗漏的问题，另一种可能性是细胞在染色后没有充分清洗，使得一些未结合的染料残留下来，这些染料进入后会标记其他细胞。延长清洗次数和时间应该会有帮助。

Calcein AM扩散到细胞中，“AM”部分由细胞酯酶裂解，随后染料分子的荧光信号可以在细胞质中被观测到，但其不结合到细胞组分。这意味着它们能够为“整个细胞”染色。这也意味着染料不能通过醛类固定剂进行交联，因此染料会在固定时丢失。此外，质膜的任何干扰（例如去垢剂或胰蛋白酶处理）都会导致染料从细胞中渗漏。

首先，确定您是在无血清条件下进行染色的。因为血清具有酯酶活性，会过早的裂解这些染料上的AM基团，进而阻止其进入细胞。染色之后即可将细胞移回含血清培养基中。除此之外，您可以尝试增加浓度和标记时间以获得更高的强度的信号。

钙黄绿素染料扩散到细胞中，“AM”部分由细胞酯酶切割，随后可以在细胞质中观察到而未结合任何胞内成分。这意味着它们标记了“整个细胞”。但是这也意味着它们可以通过正常细胞的外排机制被泵出。有时这一过程时间很短，尤其是显示出抗药性类型的细胞，除非外排被抑制（如使用丙磺舒抑制外排）。这也意味着染料不能被醛类固定剂所交联（不同于蛋白质结合CellTracker染料），因此染料会在固定时丢失。此外，质膜的任何干扰（例如去垢剂或胰蛋白酶处理）都会导致染料从细胞中渗漏。

用CellTrace试剂绘制出好的传代曲线的关键是在开始时均匀标记细胞，使它们在标记零点有紧密的变异系数（CV）。如果峰太宽，迭代相互重叠，一系列峰将成为一个驼峰。由于染色程度与细胞大小成正比，可以从统一的细胞群（而非淋巴细胞和粒细胞等混合的细胞群）开始标记，实现均匀的标记。细胞标记时间很短，所以您需要预先稀释染料，迅速混入你的细胞。请确保您的细胞未沉积在试管底部。实现这一点最简单的方法就是准备一份2X染色液（1×= 1-10μM），在一半体积（无血清或BSA）培养基中重悬细胞。将染料添加到细胞中并倒置几次以混合。染色过程中轻轻晃动细胞。染料孵育结束后（20分钟，37℃）即添加血清或BSA（至少1％），以清除任何残留的未反应染料。离心细胞，洗涤一遍，然后在完全培养基中重悬。经10-20分钟的脱酯化孵育后，细胞即可用于你们的实验。一定要确保有一个零点对照，因为您需要知道细胞第一次传代的时间。