pBAD/TOPO™ ThioFusion™ 表达试剂盒
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pBAD/TOPO™ ThioFusion™ 表达试剂盒

pBAD/TOPO™ ThioFusion™ 表达试剂盒设计用于在大肠杆菌中实现硫氧还蛋白融合蛋白的一步克隆和调控表达(图 1)。pBAD/Thio-TOPO™ 载体编码 His-Patch 硫氧还蛋白了解更多信息
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pBAD/TOPO™ ThioFusion™ 表达试剂盒设计用于在大肠杆菌中实现硫氧还蛋白融合蛋白的一步克隆和调控表达(图 1)。pBAD/Thio-TOPO™ 载体编码 His-Patch 硫氧还蛋白(作为 N 端融合伴侣)。硫氧还蛋白融合能显著增加许多难表达蛋白的溶解度,提高蛋白产量。载体包括以下附加特点(图 2):

araBAD 启动子,用于在大肠杆菌中进行严格调控表达,拓扑异构酶 I 活化载体,用于对 Taq扩增 PCR 产物进行 5 分钟 TOPO™ 克隆
• C 端多聚组氨酸 (6xHis) 标签,用于采用镍螯合树脂进行纯化,并采用抗 His(C 端)抗体进行检测
• C 端 V5 抗原决定簇,用于采用抗 V5 抗体进行检测
• 肠激酶切割位点,用于采用 EKMax™ 肠激酶高效切割 N 端融合标签
仅供科研使用。不可用于诊断程序。
规格
耐抗生素细菌氨苄青霉素 (AmpR)
细菌或酵母菌株TOP10
切割EK(肠激酶)识别位点
构成或诱导系统诱导
表达机制基于细胞的表达
表达系统大肠杆菌
诱导剂阿拉伯糖
产品类型慢病毒表达试剂盒
数量20 reactions
选择试剂(真核生物)
载体pBAD
克隆方法TOPO™-TA
产品线TOPO、ThioFusion, ThioFusion
促进剂araBAD
蛋白标记His 标签 (6x)、V5 抗原决定簇标签、硫氧还蛋白, V5 Epitope Tag, Thioredoxin
Unit SizeEach
内容与储存
每个 pBAD/TOPO™ ThioFusion™ 表达试剂盒包含两个盒和 LMG194 大肠杆菌穿刺培养物。pBAD/TOPO™ ThioFusion™ 表达盒包含所有 PCR 所需的试剂(Taq 聚合酶除外),包括 200 ng 拓扑异构酶 I 活化的 pBAD/Thio-TOPO™ 载体、无菌水、dNTP、10X PCR 缓冲液、盐溶液、对照模板和引物、20% L-阿拉伯糖、测序或 PCR 筛选用引物以及表达对照质粒。储存在 -20°C 下。One Shot™ 盒包含所有转化所需的试剂,包括 21 份单次使用的 50 µL 化学感受态 TOP10 大肠杆菌、S.O.C. 培养基和 pUC19 超螺旋对照质粒。One Shot™ 盒储存于 -80°C 下。LMG194 大肠杆菌穿刺培养物储存于 2 - 8°C 下。妥善储存时,可保证所有组分稳定储存 6 个月。

常见问题解答 (FAQ)

应使用多少L-阿拉伯糖诱导表达?

L-阿拉伯糖的用量取决于您的表达实验,我们建议在初试表达试验中采用多种不同用量的L-阿拉伯糖,范围为0.00002%至0.2%。

我应使用你们提供的TOP10细胞还是LMG194大肠杆菌菌株用于pBAD系统的表达呢?

TOP10
优点:
- 省时,可直接从克隆到表达。
- 甘油储液更稳定,因为这些菌株的基因型是endA-和recA-。
缺点:
-该菌株不是蛋白酶缺陷型的;因此,蛋白质可能被降解。

LMG194
优点:
- 可在最低限培养基中生长良好,M9除外。
- 为了表达质粒必须转化到细胞中。
-含葡萄糖的RM培养基,保证了蛋白质的低基础表达水平。
缺点:
- 不是蛋白酶缺陷型的;因此,蛋白质可能被降解。
-甘油储液可能不稳定,因为这些菌株的基因型不是recA-或endA-。

你们建议选择哪种感受态细胞株用于pBAD表达系统的表达?

我们建议使用基因型为araBADC-和araEFGH+的感受态细胞株,这种细胞可转运L-阿拉伯糖,而不会将其代谢。这对于表达研究很重要,因为在细胞内的L-阿拉伯糖水平是恒定不变的,不会随时间降低。我们可提供我们的TOP10感受态细胞或LMG194大肠杆菌菌株。

你们能否提供可用于pBAD载体中对目的基因进行测序的引物序列?

pBAD载体含有正向和反向pBAD引物,位于目的基因上下游。这些序列如下:

pBAD正向引物:5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3’
pBAD反向引物:5’-GATTTAATCTGTATCAGG-3’

你们是否有pBAD载体管盖颜色列表?

pBAD/His A 红色
pBAD/His B 橙色
pBAD/His C 黄色
pBAD/His LacZ 绿色
pBad/gIII A 黄色
pBad/gIII B 绿色
pBad/gIII C 蓝色
pBAD/gIII/calmodulin 紫色

引用和文献 (7)

引用和文献
Abstract
A protein kinase encoded by the t complex responder gene causes non-mendelian inheritance
Authors:BERNHARD G. HERRMANN, BIRGIT KOSCHORZ, KARIN WERTZ, K. JOHN MCLAUGHLIN* & ANDREAS KISPERT
Journal:Nature
PubMed ID:10647005
'Males heterozygous for the t-haplotype form of mouse chromosome 17 preferentially transmit the t-chromosome to their progeny. Several distorter/sterility loci carried on the t-haplotype together impair flagellar function in all spermatozoa whereas the responder, Tcr, rescues t-sperm but not wild-type sperm. Thus, t-sperm have anadvantage over wild-type sperm in fertilizing ... More
The cathepsin B of Toxoplasma gondii, toxopain-1, is critical for parasite invasion and rhoptry protein processing.
Authors: Que Xuchu; Ngo Huân; Lawton Jeffrey; Gray Mary; Liu Qing; Engel Juan; Brinen Linda; Ghosh Partho; Joiner Keith A; Reed Sharon L;
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:12000756
'Cysteine proteinases play a major role in invasion and intracellular survival of a number of pathogenic parasites. We cloned a single copy gene, tgcp1, from Toxoplasma gondii and refolded recombinant enzyme to yield active proteinase. Substrate specificity of the enzyme and homology modeling identified the proteinase as a cathepsin B. ... More
Bacterial cell killing mediated by topoisomerase I DNA cleavage activity.
Authors:Cheng B, Shukla S, Vasunilashorn S, Mukhopadhyay S, Tse-Dinh YC,
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:16159875
'DNA topoisomerases are important clinical targets for antibacterial and anticancer therapy. At least one type IA DNA topoisomerase can be found in every bacterium, making it a logical target for antibacterial agents that can convert the enzyme into poison by trapping its covalent complex with DNA. However, it has not ... More
Degradation of corn fiber by Clostridium cellulovorans cellulases and hemicellulases and contribution of scaffolding protein CbpA.
Authors:Koukiekolo R, Cho HY, Kosugi A, Inui M, Yukawa H, Doi RH,
Journal:Appl Environ Microbiol
PubMed ID:16000754
'Clostridium cellulovorans, an anaerobic bacterium, degrades native substrates efficiently by producing an extracellular enzyme complex called the cellulosome. All cellulosomal enzyme subunits contain dockerin domains that can bind to hydrophobic domains termed cohesins which are repeated nine times in CbpA, the nonenzymatic scaffolding protein of C. cellulovorans cellulosomes. In this ... More
Factor B and the mitochondrial ATP synthase complex.
Authors: Belogrudov Grigory I; Hatefi Youssef;
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:11744738
Factor B is a subunit of the mammalian ATP synthase complex, whose existence has been controversial. This paper describes the molecular and functional properties of a recombinant human factor B, which when added to bovine submitochondrial particles depleted of their factor B restores the energy coupling activity of the ATP ... More