含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒

miRNA有时会在RNA Pol II（Lee et al，2004）的驱动下，在长初级转录本中成簇表达。我们的载体支持miRNA串联，使它们可以在一个初级转录本中表达，从而确保多个miRNA的共表达。在最后的重组质粒中，原来的限制性酶切位点会重新出现，使重组质粒能够进行多次串联。下图揭示了将2个来自不同miRNA载体的miRNA串联进入1个miRNA表达载体的原理。注意：将靶向不同基因的miRNA串联在一起，通常会稍微削弱其对各自基因的敲低作用。将靶向相同基因的不同miRNA或者相同的miRNA串联在一起，会增强敲低作用。由于miRNA串联增加了转录本的加工过程，因此，EmGFP的表达会被削弱。见使用手册第33页对如何串联pre-miRNA的说明。

根据已发表的文献（Tsien，1998），pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体中EmGFP的激发和发射波长分别为487 nm和509 nm。可使用标准FITC滤波装置进行检测。我们推荐使用Omega XF100。

推荐使用我们的pcDNA6.2GW/EmGFP-miR载体，其中，EmGFP与目标miRNA共同表达。您将看到EmGFP表达与miRNA的敲低活性呈100%相关性。

载体经过设计和优化可用于表达经修饰的miR155结构，并最终生成通过RNAi通路实现基因打靶的siRNA。如果想用来表达天然miRNA，可能还需更多优化。或者，也可将天然miRNA克隆进入标准蛋白表达载体，并检查是否有miRNA产物。请查看我们针对miRNA过表达给出的2个建议：

1. 对gDNA进行PCR，扩增内源性pre-miRNA发夹以及两侧约为50–80 bp的侧翼序列，然后TOPO克隆进入表达载体，例如我们的pcDNA载体。这将会产生一个包含天然侧翼序列和pre-miRNA的转录本。这将可能成为最佳的内源性miRNA类似物，因为侧翼序列和前导miRNA含有正确的加工生成成熟miRNA所需的信息。该技术的缺点在于有点费时费力并且不适合用于分析多种miRNA（每个都需要识别基因位点、引物设计和成功的PCR）。

2. 在Invitrogen BLOCK-iT Pol II miR RNAi载体系统中，使用成熟miRNA序列（或它的前21个核苷酸）作为“反义”序列。该技术已成功发表（见Lee et al，PNAS 2006；103；15669-15674），可实现快速、简单的设计和克隆。

该方法能够以相同的方式建立许多miRNA载体。我们也非常明确miR RNAi载体的主要产物具有预期的成熟miRNA 5’末端。但是，我们也知道3’末端是可变的，可能会包括一些包含茎环序列核苷酸（GUU……）的稍小或稍长的种类。3’末端可能对miRNA功能来说最不重要，但是对于某些miR-target相互作用可能较为重要，只是我们并不知道这些类似物与内源性miRNA有多接近。

该载体可用于稳定表达并且能够使用病毒导入。该miR RNAi载体包括内源性 miRNA 的侧翼序列和茎环序列，可指导从较长的Pol lI转录本（pri-miRNA）上切除改造过的miRNA。当存在细胞核时，这些载体可有效使用内源性细胞器加工生成具有敲低作用的序列，这些经过特殊设计的序列与您的目标序列具有100%同源性，可引起靶标切割。此外，茎环序列具有特殊的限制性酶切位点，因此，它能够实现线性化而获得更有效的测序，这对具有发夹结构的标准的shRNA有时是一个挑战。使用该试剂盒可获得超过70%的敲低成功率，轻松追踪表达（可共同表达绿色荧光蛋白），实现同时敲低多个靶标以及组成型或诱导型表达。