BLOCK-iT™ U6 RNAi 入门载体试剂盒

不能，您使用的入门载体应含有可使shRNA发生RNA聚合酶III依赖性表达所需的元件（即，Pol III启动子和终止子）。

在建立稳定细胞系时，量效曲线或杀伤曲线是一种用于确定最佳抗生素使用浓度的简单方法。为确定杀死全部未转染细胞所需的最低抗生素用量，可将未转染细胞置于含有不同浓度抗生素的培养基中生长。做量效曲线或杀伤曲线的基本步骤如下：

•以汇合度25%的细胞密度将未转染细胞接种到培养皿中，并加入含递增浓度抗生素的培养基使细胞生长。对于某些抗生素，您将需要计算活性药物量以控制批次间差异。
•每3-4天补充选择培养基。10-12天后，检测培养皿中的活细胞数。在出现细胞死亡前，细胞可能在选择培养基中分裂过1-2次。
•找到杀死全部细胞所需的最低抗生素浓度，即用于建立稳定细胞系所需的最佳抗生素浓度。

很遗憾，pENTR/U6载体不含筛选标记；因此，只能实现瞬时RNAi分析。如果您想建立稳定细胞系，可通过LR反应将shRNA克隆进入合适的Gateway目的载体中，生成表达克隆。

pENTR/H1/TO载体含有Zeocin抗性基因，方便制作能够诱导表达目的shRNA的细胞系。可通过做一个杀死曲线，确定杀死未转染哺乳细胞所需的Zeocin最低浓度。请注意，Zeocin敏感性细胞不会聚集和脱离培养皿，但可能会出现体积增大、细胞形态异常、细胞质中形成较大的空泡或细胞膜/和膜分解。

您可使用长度在4-11个核苷酸范围内的任何环序列，但是，通常优先选择较短的环（即，4-7个核苷酸）。应避免使用含有胸腺嘧啶核苷酸（T）的环序列，否则有可能会导致过早转录终止，特别是在目标序列本身以1个或多个T核苷酸终止的情况下。以下是一些我们推荐使用的环序列：

•5’ – CGAA – 3’
•5’ – AACG – 3’
•5’ – GAGA – 3’

shRNA的转录从U6启动子序列末端后面的第一个碱基开始。在上游链寡核苷酸中，转录起始位点相当于4 碱基 CACC序列后的第一个核苷酸，加入4 碱基 CACC序列是为了实现定向克隆。我们建议以鸟嘌呤核苷酸（G）作为shRNA序列的起始，因为天然U6snRNA的转录是以G开始的。请注意下列情况：

•如果G是目标序列的一部分，则将G并入上游链寡核苷酸的茎序列，并在上游链寡核苷酸的3’端加一个互补C。
•如果G不是目标序列的第一个碱基，我们建议直接在上游链寡核苷酸5’末端紧随CACC突出序列后加一个G。这种情况下，不要在上游链寡核苷酸的3’末端添加互补C。注意：我们已经发现，在这种情下添加互补C，可导致shRNA活性降低。或者，如果没有特别想以G作为转录起始，则应使用腺嘌呤核苷酸（A），而不要使用C或T。但是，应注意的是，除了G以外，使用其它任何一种核苷酸都会影响起始效率和位置。