pIB/V5-His TOPO™ TA 表达试剂盒

我们不建议将感受态细胞保存在液氮中，因为极端温度会损害细胞。另外，装感受态细胞的塑料管子可能承受不了如此低的温度，从而发生破裂。

我们推荐将感受态细胞存储在-80摄氏度。高于这个温度，即使存储时间很短，也会显著降低其转化效率。

尽管Kozak序列在哺乳细胞翻译起始中的重要性已被证明，但昆虫细胞中是否也严格遵循Kozak规则仍有争议。确定其重要性的唯一方法是，对相同蛋白从不同起始序列的表达进行直接对比。即使这样，一种蛋白实现最佳表达所使用的规则可能并不适合其它蛋白。以下四篇文献证明了Kozak序列对昆虫细胞中的表达效率无任何影响：

•Hills D, Crane-Robinson C (1995) Baculovirus expression of human basic fibroblast growth factor from a synthetic gene: role of the Kozak consensus and comparison with bacterial expression. Biochim Biophys Acta 1260(1):14–20.
•Ranjan A, Hasnain SE (1995) Influence of codon usage and translational initiation codon context in the AcNPV-based expression system: computer analysis using homologous and heterologous genes. Virus Genes 9(2):149–153.

ATG通常对于高效的翻译启始是足够的，尽管翻译效率要视目的基因而定。最佳的建议应是保持cDNA中天然起始位点，除非确定这一位点的功能性不理想。如果从表达的角度来考虑，推荐构建并测试两种载体，一个具有天然的起始位点，另一个具有保守的Kozak序列。通常情况下，所有N-端融合型表达载体都已包含了一个RBS或翻译起始位点。

我们建议起始摩尔比为1:1(插入片段：载体)，范围为0.5：1到2：1(插入片段：载体)。对TOPO克隆来说，2kb大小的 PCR产物的ng值应在5- 10ng之间。

计算公式：< br / > 插入片段长度（bp）/ 载体长度（bp）x 载体用量（ng）= 插入片段：载体比为1：1时所需的插入片段的用量（ng）。