InVision™ His-Tag 胶内染料

这可能是因为曝光过度——为检测低表达水平的目标蛋白而加长曝光时间，可能导致BenchMark His标签蛋白标准品中的微量污染物显色。可降低BenchMark His标签蛋白标准品的上样量，或者先以较短的曝光时间对标准品进行成像，然后以较长的曝光时间对低表达水平蛋白进行成像。

以下是可能原因和解决方案：

•遗漏了洗涤步骤。应使用20 mM磷酸盐缓冲液洗涤凝胶2次。如果背景很高，应进行第3次水洗并洗涤10分钟。 •水质较差。应使用超纯水（电阻率大于18 megohm/cm）洗涤和制备磷酸盐缓冲液。
•蛋白质上样量过多。降低蛋白浓度或减少上样体积。
•成像平台不干净。每次进行凝胶成像前都应使用纸巾清洁成像系统，以最大程度的降低背景荧光。
•非特异性条带。强碱性蛋白和二价金属结合蛋白，如碳酸酐酶（30 kDa）、SlyD（21 kDa）和磷酸化酶 B（97 kDa），可与染色剂发生交叉反应，产生非特异性条带。

以下是可能原因和解决方案：

•染色不充分。应使用适合所用凝胶类型的染色方案。使用BenchMark His标签蛋白质标准品作为阳性对照，对染色试剂和方案进行验证。避免过度洗涤凝胶。
•凝胶显色或成像不恰当。应使用带有照相机的紫外透照仪和具有正确滤镜的激光扫描仪（详情见使用手册）进行凝胶成像。不建议使用Polaroid照相机。应确保照相机光圈打开并有足够的光进入，并且照相机应连接到可调整对比度的成像软件上，从而获得最佳的图像。完成洗涤步骤后，应立即对凝胶成像。将凝胶保存在磷酸盐缓冲液中，会降低信号强度。
•蛋白上样量或表达水平较低。应使用总蛋白染色剂对凝胶进行染色，检测凝胶的总蛋白含量（见使用手册第13页）。至少上样1 pmole的His标签融合蛋白进行检测。应确保His标签是框内融合[读码框正确]，并且蛋白表达正常。

由于E-PAGE凝胶比标准小型凝胶更厚，因此，使用InVision His-Tag In-Gel Stain染色会产生过强的背景。为获得更好的染色灵敏度，我们建议先将E-PAGE凝胶上的蛋白质转印到硝化纤维素膜上，然后根据使用手册第14页的说明使用InVision His-tag In-gel Stain对印迹膜进行染色。

为了将经过InVision His-Tag In-Gel Stain染色的His标签融合蛋白用于免疫印迹分析，应该

•在His标签融合蛋白染色后，记录凝胶的永久性图像
•将凝胶置于1X SDS电泳缓冲液中平衡1小时。
•使用所选方法进行免疫印迹分析和免疫检测。