Qdot™ 545 ITK™ 链霉亲和素偶联物试剂盒

以下是我们的建议：

•使用我们偶联了明亮的、光稳定性Alexa Fluor 染料的二抗。每个荧光二抗IgG分子上标记有2-8个荧光基团，每个一抗含有三个潜在的二抗结合位点，能够提供大约10-20荧光团/抗体的信号放大等级。
•此外，也可采用生物素结合的二抗以及荧光素-链霉亲和素偶联物检测一抗，或者采用链霉亲和素桥连Qdot 生物素等生物素结合的报告载体来检测一抗。尽管额外的孵育和内源性生物素封闭步骤会增加处理时间，但链霉亲和素标记也会提高检测灵敏度。
•对于低丰度的靶标，为得到最佳信噪比，可能要对信号进行放大。酪胺信号放大技术（TSA）是一种酶介导的检测方法，其利用辣根过氧化物酶（HRP）的催化活性产生具备反应活性的荧光团标记酪胺自由基。这些短寿命的酪胺自由基共价结合到相互作用位点临近的残基上，在HRP-靶相互作用位点上产生放大的荧光信号。
•如需提升快速漂白染料的检测灵敏度，我们的SlowFade Diamond或ProLong Diamond 抗猝灭试剂已经证实可增加光稳定性，降低固定细胞、组织和无细胞制备物中的初始荧光淬灭。
•请访问此网页（https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/newsletters-and-journals/bioprobes-journal-of-cell-biology-applications/bioprobes-issues-2011/bioprobes-66-october-2011/guide-to-immunocytochemistry.html）了解进一步的优化的要点。

放大抗体检测效果的常用方法是生物素-链霉亲和素检测，使生物素化的二抗结合偶联染料的链霉亲和素。该方法能够将信号放大约2-8倍，但在此之前必须先封闭内源性生物素。另一种方法是使用酪胺信号放大技术，将辣根过氧化物酶偶联物与染料标记的酪胺配合使用。该方法能够将信号放大约10-20倍，但在此之前必须先封闭内源性过氧化物酶。最后一种方法是使用Qdot纳米晶体抗体或链霉亲和素偶联物，根据Qdot颜色，该方法可产生高于标准有机染料偶联物40倍的信号。

部分建议如下：

•使用Qdot 孵育缓冲液（货号Q20001MP）
内附的缓冲液具有特殊配方，在大多数使用Qdot链霉亲和素偶联物免疫标记应用中，均可提高信噪比。其它缓冲液可能会导致更多的不均匀着色，并且尤其可能增加背景着色。然而，一些特别的应用可能会需要其他缓冲液条件。请参见实验方案“使用Qdot链霉亲和素偶联物进行双重标记”（Double-labeling Using Qdot Streptavidin conjugates.）。

•确定样品是否含有高水平的内源性生物素。对样本进行亲和素-生物素预封闭
如果使用Qdot孵育缓冲液却依然得到较高的非特异性背景信号，则可能必须检查操作流程中的其他步骤。用BSA或正常动物血清封闭样品可以降低抗体和Qdot链霉亲和素偶联物的非特异性结合。最好的做法是使用封闭缓冲液稀释您的一抗和二抗。另外，肝脏和肾脏等组织的切片可能含有内源性生物素，其可能产生非特异性信号。内源性生物素能够用亲和素/生物素封闭试剂盒（货号E21390）封闭。

•背景中出现染色颗粒或块状荧光物质
随着时间推移，Qdot孵育缓冲液中的BSA偶尔会轻微聚集。在使用Qdot链霉亲和素偶联物标记样品前必须移除这些聚集物。添加到样品前，可通过离心将孵育混合液中的聚集物沉淀下来。将样品在台式离心机（Eppendorf 5415）中5,000 x g离心2分钟来完成此过程。在将孵育混合液添加到样品中前，也可将其通过0.2 µm的滤膜离心柱以去除微观沉淀。如果你使用Qdot孵育缓冲液之外的其它缓冲液，往往会导致孵育缓冲液中的NaCl或其他盐浓度过高，可能很难通过过滤法解决。在这种情况下，须减少整体盐浓度。

•优化生物素化的二抗工作浓度
调节染色过程中所用的生物素化抗体水平，能够帮助优化特异性信号。为实现特异性标记，必须要提供较高水平的生物素化抗体，但抗体水平过高又会导致抗体与样品发生非特异性结合。Qdot链霉亲和素偶联物会连接到非特异性结合的生物素化抗体上，导致较高的背景染色。

•优化Qdot链霉亲和素偶联物的工作浓度
正如免疫标记应用中，滴定一抗和二抗是维持最佳的特异信号的必备条件，应该对每个种偶联物都应该优化其工作浓度。总的来说，等于或轻微低于饱和浓度的情况下可获得最佳的信噪比，相反，当高于饱和浓度时将会导致背景信号升高。

以下为我们的一些建议：

•确认成像/检测设置是否适当
确保使用合适的滤镜组来检测信号。请查阅Qdot生物素使用手册的表1来获取适当的滤镜信息。

•用替代光源检查Qdot偶联物是否发荧光。
Qdot偶联物通常会在手持式紫外灯（长波长，例如用于显示琼脂糖凝胶上溴化乙锭的这类紫外灯）下发出强的荧光。尽管在任何测试过的储存条件下我们暂未发现这些Qdot产品有明显的荧光损失，但我们毕竟没法逐个考察所有储存条件。如果Qdot产品在长波长UV激发下没有出现荧光，请联系techsupport@qdots.com获取技术支持。利用显微镜，可以进行光斑检测：在一块干净的载玻片上（无盖玻片）滴上一小滴（2到5 μL）的量子点溶液，并在适当的滤片和低放大倍数下检测。

•确认一抗的特异性和滴定量
确保抗体可以识别预定的靶标，同时确保有足够的一抗能结合到靶点。可以通过ELISA法捕获靶标抗原或根据实验室手册（例如免疫学最新手册）所述的其他技术来进行验证。

•对于Qdot链霉亲和素偶联物，请确认抗体具有生物素化修饰
确保抗体被有效生物素化修饰。另外，可能需要单独调节实验所用的一抗和二抗浓度来优化信号并降低背景信号。

•PAP笔墨水可能会淬灭信号
使用替代方法隔离玻片上的靶向区域。如果您的方案需要用到PAP笔，我们推荐采用Vector Labs的ImmEdge免疫组化笔（货号H-4000）

在3,000 rpm下离心ITK Qdot纳米晶3-5分钟，可以从上清中去除白色沉淀，之后就可以直接使用上清了。