293A 细胞系

大多数腺病毒包含在漂浮的细胞中，细胞破裂之前它们并不会释放到培养基中。我们推荐每三天左右更换一次培养基，直至大量细胞变大变圆，并从塑料培养皿上脱离下来。一旦细胞发生破裂，游离的病毒就会迅速感染邻近的细胞。如果您很担心在更换培养基的过程中损失这些受到感染的细胞（及内在的病毒），您可保留含有漂浮细胞的培养基，冻/融三次后将其中的一小部分（可能1/10左右）与新鲜培养基一道重新加回新鲜培养基中。或者，您也可使用新鲜培养基，以显著高于每三天一次的频率进行半换液。

任何293来源的细胞系及其他表达E1蛋白的细胞系均适用于腺病毒的生产。293A中A代表“贴壁”，是因为293A细胞（只是常规293细胞的一个单细胞克隆）具有贴壁的倾向，在组织培养皿中会形成平铺生长良好的单层细胞。这就是为什么这些细胞很适合应用于噬斑测定实验。普通的293细胞不会形成这样的单层细胞；它们生长所形成的细胞层会出现孔洞和空白之处。

我们使用经测试不含支原体的Gibco FBS（货号16000-044），并用下列塑料器皿进行293A细胞的培养：

T175—Fisher 货号 10-126-13；这是一款Falcon培养瓶，带有0.2 μm透气孔的密封盖。
T75—Fisher 货号 07-200-68；这是一款Costar培养瓶，带有0.2 μm透气孔的密封盖。
100 mm 平板—Fisher 货号 08-772E；这是一款针对组织培养应用进行预先处理的的Falcon聚苯乙烯平板。
我们在日常的细胞培养/维持过程（除在293A细胞中生成腺病毒时的细胞裂解过程）中使用这些平板获得了绝佳的贴壁效果。

在将表达克隆转染进293A细胞之前，您须暴露载体上左侧和右侧的病毒反向末端重复序列（LTRs），以辅助病毒复制和包装过程的顺利进行。同时，这一操作也将去除细菌序列（即pUC来源和氨苄青霉素抗性基因）。pAd/CMV/V5-DEST和pAd/PL-DEST载体均包含Pac I限制性酶切位点（请分别参见使用手册第20页和第22页图谱中的Pac I位点）。

注意：请确保你的目的DNA序列中不含任何Pac I限制性酶切位点。如果您无法应用Pac I位点进行处理，您也可换用Swa I位点。

Most of the adenovirus is contained within the floating cells and is not released into the medium until those cells burst. We recommend changing the medium every 3 days or so until it is obvious that a lot of cells become big and rounded and are detaching from the plastic. Once a cell bursts, the free viruses rapidly infect the neighboring cells. If you're ever worried that you're losing infected cells (and therefore potential virus) in your medium changes, you can always save the medium with the floating cells, freeze/thaw it 3 times and then use a little (maybe 1/10th) and add it back to your culture with fresh media. Or, replace only half of the medium with fresh medium and do this more often than every three days.