Flp-In™ T-REx™ 293 细胞系

几乎所有批次的FBS中都含有四环素，因为FBS通常从奶牛中获得，而它们的饮食中有四环素。如果细胞培养于含有未去除四环素的FBS的培养基中时，目的基因就会出现低水平的基底表达情况，即使用户未主动添加四环素。在这一情况下，我们推荐您购买我们的Gibco细胞培养低四环素含量的FBS。为了确保四环素的清除效果，这些批次产品中四环素的含量应低于19.7 ng/mL（这一数值应为分析检测阈值）。

注意：Tet-抑制子蛋白与四环素的结合常数为3 nM。假设培养基中含有10%的血清，而血清中四环素的浓度为19.7 ng/mL，则相当于4 nM的四环素。因此请记得，即便使用了低四环素的FBS，仍有可能存在本底水平的表达。

在理论上来讲，用户能够实现Flp-In表达载体的多重整合效果——这其中包含了一个FRT-特异性的整合事件和一个随机的第二位点整合事件。不过，随机整合的发生概率相对较低。转染过程中所用DNA的有限数量将减少第二位点的整合概率。我们向293细胞（缺少FRT位点）中转染了pcDNA5/FRT载体，并在筛选了200个以上的克隆后，鉴定到一个潜在的第二整合位点。用户可通过Southern杂交来检测DNA的整合位点。单一整合元件会显示为独立的一个条带；两个整合位点：两个条带；三个位点，三条带，如此延续。我们将一些Flp-In表达细胞系培养了四个月以上，无论是否向培养体系中加入潮霉素，均未发现Flp-In表达载体发生任何形式的丢失。

当执行共转染时，用户无法在稳转细胞系中同时完成功能性TetR或GeneSwitch蛋白的双重测试。另一方面，如果执行连续转染，用户就可对所生成的T-REx或GeneSwitch细胞系进行功能性测试，他们可将LacZ对照表达质粒瞬转进入细胞，并挑取那些在诱导剂缺乏条件下表达LacZ的本底水平最低，而在含诱导剂条件下LacZ表达水平最高的克隆。之后可对这一克隆进行扩增，并按需用于T-REx或GeneSwitch表达载体的转染实验。

使用GeneSwitch系统能够确保目的基因处于极低的基础表达水平，而T-REx系统可能会有少量渗漏表达，因为FBS中不可避免的存在着一些四环素。GeneSwitch系统的诱导表达水平可能甚至高于CMV启动子。GeneSwitch系统的劣势在于，尽管该系统能够在转基因条件下以优异的性能工作，但在培养系统中关闭表达的操作不是很容易实现。而另一方面，T-REx系统可通过加入和去除诱导剂来切换开关状态。

我们提供向HEK293细胞中稳定整合了pFRT/lacZeo和pcDNA6/TR的Flp-In T-REx系统。该细胞系经功能性测试，能够有效调控目的基因的表达。