pPIC3.5K 毕赤酵母载体

通常，大菌落代表含pPIC6/pPIC6α整合体的转化株，而小菌落代表含pPIC6/pPIC6α非整合体的转化株。这些非整合体转化株已经转导了pPIC6/pPIC6α质粒，因此，在起始筛选过程中表现出低水平的杀稻瘟菌素抗性。在后续筛选中，这些非整合体转化株不会保持杀稻瘟菌素抗性。

当您为表达实验选择杀稻瘟菌素抗性转化株时，我们建议您从起始转化培养皿中挑选杀稻瘟菌素抗性菌落，然后在第二个含有适当浓度杀稻瘟菌素的YPD培养皿中划线。应选择可保持杀稻瘟菌素抗性的转化株用于下一步研究。

•应确保收集的是处于对数生长期的细胞（通常OD <1.0）。
•如果使用电穿孔法，应查看电穿孔仪使用手册中的推荐条件。可根据需要，改变电穿孔参数。
•使用更多的DNA。
•使用新鲜配制的感受态细胞。
•如果使用LiCl转化法，可尝试煮沸载体DNA。

应考虑以下几点：

1.如果所用细胞的OD值过高，则它们不能形成原生质球。不要使细胞过度生长。
2.不要使用衰老的细胞，应确保细胞处于对数生长期。
3.使用前，将酵母裂解酶混合均匀。酵母裂解酶更大程度上是一种悬液，而非溶液。
4.每次都使用新鲜配制的PEG溶液，并检查pH。

以下是用于培养Pichia pastoris和S. cerevisia的营养丰富型和基本培养基：

营养丰富型培养基：

适用于S. cerevisiae和Pichia pastoris
•YPD（YEPD）：酵母提取物、蛋白胨和葡聚糖
•YPDS：酵母提取物、蛋白胨、葡聚糖和山梨醇

仅适用于Pichia pastoris
•BMGY：缓冲型甘油复合培养基
•BMMY：缓冲型甲醇复合培养基

基本培养基（又名缺陷型培养基）：

适用于S. cerevisiae
•SC（SD）：完全合成培养基（YNB、葡聚糖（或棉籽糖或半乳糖）以及氨基酸）

适用于Pichia pastoris

•MGY：基本甘油培养基
•MD：基本葡聚糖培养基
•MM：基本甲醇培养基
•BMGH：缓冲型基本甘油培养基
•BMMH：缓冲型基本甲醇培养基

pGAP克隆可使用以下高细胞密度实验方案。加入碳料，直至达到所需的细胞密度（细胞湿重（WCW）为300-400 克/升）。如果发酵罐中的蛋白状态良好，可增加至300–400 克/升 WCW，与甲醇诱导型克隆相似。在发酵后48小时内，可达到该密度。我们已经使用这些方案，使组成型表达载体在甘油中进行发酵，并得到良好的结果。您可能需要对发酵基础盐培养基做以下改进：

1) 在分批发酵培养基中，用2%葡聚糖代替4%甘油。
2) 在补料生长培养基中，用40%葡聚糖代替50%甘油。
3) 以12 毫升/升/小时的速度补加40%葡聚糖（Jim Cregg已经发表使用多种碳源作为底物进行表达的数据；葡聚糖带来最高表达水平）。
4) 可在培养基中加入酵母提取物和蛋白胨，维持蛋白稳定性。

警告：如果您在使用His-酵母株，使用pGAPZ转化后，酵母株依然是His-标记的。使用基本培养基发酵时，需要在发酵罐中加入组氨酸。