pLenti6.2-GW/EmGFP 表达对照载体

这可能是由于在筛选过程中应用了过量的杀稻瘟菌素所致。通过开展杀伤曲线分析来确定您所用细胞系的抗生素敏感性。使用能够有效杀灭未转导细胞系的最低抗生素浓度。

启动子被沉默或在荧光显微镜下使用了错误的滤镜组来观察细胞培养物/流式细胞仪上的检测参数错误可导致稳定转导后看不到EmGFP的表达。应筛选多个耐受抗生素的细胞克隆，并挑选其中表达水平最高的一个。请确保在倒置荧光显微镜上使用FITC或Omega XF100滤镜组或在您的流式细胞仪中准确应用FITC检测参数。

表达量低可能是由于低转导效率，MOI值过低或转导操作后过早收获了细胞。应确保在Polybrene试剂存在的条件下进行细胞转导，检查和/或使用更高的MOI值， 至少在转导后48-72小时后再收获细胞。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：

- 在荧光显微镜下使用了错误的滤镜组来观察细胞培养物，或流式细胞仪上的检测参数错误：请确保在倒置荧光显微镜上使用FITC或Omega XF100滤镜组或在您的流式细胞仪中准确应用FITC检测参数。
- 病毒母液未正确储存：分装并将母液保存于–80°C下的冻存管中。请勿将其冻融超过3次。
- 转导过程中未加入Polybrene试剂：在Polybrene试剂存在的条件下向细胞中转导pLenti6.2-GW/EmGFP。
- EmGFP表达时间过短以致难以观察： 如需获得最佳的EmGFP表达水平，请在转导4天后进行观察。

理论上，pDONR载体在BP反应时对插入片段没有大小的限制。我们自己测试过的最大片段是12 kb。TOPO载体对插入片段大小更敏感一些，要获得较高的克隆效率其插入片段长度的上限是3-5 kb。