pBudCE4.1 哺乳动物表达载体

您可设计一条双顺反子转录本实现这一操作 - 即在这一转录本中，两个基因之间通过一个内部核糖体进入位点（IRES）序列分隔开来，从而在同一个公用的上游启动子控制下，分别作为两个单独的转录读码框实现表达。另外，您也可以使用包含两个独立启动子的载体来起始两个不同基因的表达，从而更为有效地控制细胞中的基因拷贝数。我们提供pBud/CE4.1载体（货号 V53220），基于同一质粒来独立表达两个基因。该质粒同时包含CMV和EF1α启动子，为两个基因提供近乎均等的表达水平。这一载体同时携带了Zeocin抗生素抗性基因，来辅助用户开展稳转筛选。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：

•所用检测法可能不适当或不够灵敏： ◦我们推荐您优化检测方案或寻找更为灵敏的方法。如果使用考马斯亮蓝染色/银染法检测过该蛋白，我们则推荐您使用免疫印迹法来增加检测灵敏度。裂解产物中存在的内源蛋白可能会在考马斯亮蓝染色/银染过程中掩盖目的蛋白。如果可能，我们推荐您在免疫印迹实验中包括一个阳性对照。
•筛选到的克隆数不够：至少筛选出20个克隆。
•在稳转筛选中使用了不适当的抗生素浓度：请确保正确获取了抗生素的杀死曲线。由于某一既定抗生素的效力依赖于细胞类型，血清，培养基和培养技术，因此必须在每次进行稳定筛选的时候确定抗生素的用量。如果采用的培养基或血清条件明显不同，则即使是我们所提供的稳转细胞系对于我们推荐的剂量也可能出现更敏感或更不敏感的情况。
•基因产物（即使低水平）的表达可能与该细胞系的生长不相容（如毒性基因）：使用一个可诱导的表达系统。
•阴性克隆可能由基因表达的关键载体位点处优先发生了线性化所致：在一个不影响表达的位点实施载体线性化，如在细菌抗药性标志物序列中。

这里列举了一些可能的原因与解决方案：

•尝试试剂盒自带的表达对照。
•可能的检测问题：
◦检测瞬转的表达蛋白可能有难度，因为转染效率可能过低，以致用于整个转染群体的评估手段无法成功实现检测。我们推荐您通过稳转筛选或采用能够逐个检测单一细胞的技术手段来优化您的转染操作。您也可尝试通过改变启动子或细胞类型来提高表达水平。
◦细胞中的蛋白表达水平对于所选择的检测方法来说可能过低。我们推荐您优化检测方案或寻找更为灵敏的方法。如果使用考马斯亮蓝染色/银染法检测过该蛋白，我们则推荐您使用免疫印迹法来增加检测灵敏度。裂解产物中存在的内源蛋白可能会在考马斯亮蓝染色/银染过程中掩盖目的蛋白。如果可能，我们推荐您在免疫印迹实验中包括一个阳性对照。
◾蛋白可能降解或截短了：使用Northern杂交进行检测。
◾可能的时程问题：由于蛋白表达随时间延长而发生的变化依赖该蛋白的天然属性，我们一般推荐您先获取一份表达的时程曲线。尝试进行一次时程分析将帮助您确定最优的表达时间窗。
◾可能的克隆问题：通过限制性酶切和/或测序来验证克隆。

不可以；新霉素对哺乳动物细胞有毒性。我们推荐您使用Geneticin（又称 G418硫酸盐)，这一产品的毒性较低，是在哺乳动物细胞中进行有效筛选的新霉素的替代品。

即使缺乏Kozak序列，翻译也还是会在核糖体遇到的第一个ATG处启始，不过启始效率可能相对较低。只要处于最初ATG的阅读框内，任何下游的插入序列都可能表达为融合蛋白，不过如果这里没有Kozak保守序列，则蛋白的表达水平预期会比较低。如果载体中包含一个非Kozak型的保守ATG，我们则推荐您将基因克隆至该ATG上游，再包含一个Kozak序列来优化表达效果。