WesternDot™ 625 Western 印迹试剂盒

以下是可能原因和解决方案：

- 膜被指纹或角蛋白污染： 始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
- 二抗浓度较高： 按照推荐方法稀释二抗。如果背景仍然很高，但条带强度也很高，则应降低二抗的浓度。
- 一抗浓度较高： 降低一抗浓度。
- 一抗对蛋白标准品具有亲和力： 向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。

以下是信号弱/无信号的可能原因和解决方案：

- 转印效果差或转印不完全： 检查转印条件或重复转印。使用阳性对照和/或分子量标记物。
- 硝化纤维素膜未完全湿润，或PVDF膜未完全再活化： 按照使用手册第12页的说明，预润湿或再活化膜。
- 二抗浓度过低： 使用推荐的二抗浓度。
- 一抗浓度过低： 将一抗浓度调整为标准免疫印迹检测所需一抗浓度的2倍。如果信号仍然很低并且背景不高，可增加浓度。
- 一抗失活： 通过点印迹法或其他方法确定抗体活性。
- 一抗与抗原的亲和力较低： 获取更高亲和力的一抗。
- 样品制备不当；抗原性减弱或损毁： SDS和还原剂可能干扰一些抗体/抗原亲和力。
- 样品太稀： 提高蛋白质样品的浓度，或增加上样量。
- 印迹太旧： 蛋白质会随时间降解。应使用新制备的印迹。
- 目标蛋白跑出凝胶： 应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。
- 蛋白质保留较差： 较大的蛋白质需要较长的转印时间，较小的蛋白质所需转印时间较短。使用具有相关大小 蛋白质的分子量标记物。使用具有适当结合能力的膜。
- WesternDot试剂被冷冻： 在冷冻温度下，Qdot探针会发生不可逆性聚集。

以下是可能原因和解决方案：

- 封闭不充分或发生非特异性结合： 尝试使用不同的封闭剂或增加封闭剂浓度。一般情况下，使用2%酪蛋白、5%脱脂奶粉或1/2x鱼血清可得到良好的结果。
- 使用BSA封闭膜： 不要使用含BSA的溶液封闭或孵育WesternDot标记物。对于不能兼容酪蛋白或牛奶（如许多抗磷蛋白抗体）的一抗，应使用鱼血清或含0.5% BSA的溶液进行一抗孵育，然后换成2%酪蛋白或5%脱脂奶粉完成所有其他孵育步骤。
- 膜污染： 仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。
- PVDF膜本身具有较高的背景： 改为使用硝化纤维素膜。
- 硝化纤维素膜未完全湿润： 遵循预润湿膜的说明。
- 洗膜不充分： 遵循推荐的洗膜次数。在一些情况下，可能有必要增加洗膜次数和时间。
- 一抗和/或二抗浓度过高： 通过点印迹法确定最佳抗体浓度，必要时可稀释抗体。

如果是大量沉淀，则可能表示试剂被冷冻过，应丢弃。在冷冻温度下，Qdot探针将发生不可逆性聚集。保存于2-8℃时，形成少量沉淀属于正常情况。我们建议每次使用时将WesternDot试剂在微型离心机中短暂离心，除去保存期间形成的所有少量沉淀，仅使用上清液。

细胞裂解物样品中的许多内源性生物素化蛋白也会被链霉亲和素WesternDot标记物检测到。将对照印迹膜放在链霉亲和素WesternDot标记物中孵育，而不经过一抗和二抗孵育，可确定内源性生物素化蛋白。这些内源性生物素化蛋白条带在所有含有相同类型细胞裂解物的泳道中都是一致的，可将其作为上样内参或在免疫检测前使用内源性生物素染色封闭剂（货号E21390）将其封闭。