请考虑以下可能原因：

• pH > 9：检查PCR扩增反应的pH值，并使用1 M Tris-HCl, pH 8的缓冲液进行调节。
• PCR产物过多（或过度稀释）：减少PCR产物的用量（或增加其浓度)
• PCR反应延伸不完全：确保PCR反应最后包含一个7到30分钟的延伸步骤。长的PCR产物将需要更长的延伸时间。
•克隆长插入片段（>1 kb）：请尝试以下一个或全部建议：提高插入片段用量。延长 TOPO克隆反应孵育时间。使用硅基DNA纯化系统（如PureLink系统）或者电洗脱法对插入片段进行凝胶纯化。确保所有溶液均不含核酸酶（例如避免共用溴化乙锭染色器皿）。
•尽管你使用了Taq聚合酶但是PCR产物仍然没有足够的3´ A突出：提高最后的延伸时间以确保所有的3´末端被腺苷化。Taq聚合酶在模板链的A后面再添加一个A时的效率较低。Taq聚合酶在模板链的C后边添加一个A时的效率最高。您可能需要重新设计引物以使它们包含一个5´ G而非一个5´ T。