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研究人员掌握多种基因递送技术,可将质粒 DNA、siRNA 或双链 RNAi、寡核苷酸和 RNA 导入真核细胞,用于各种研究和药物发现应用。下表对这些技术进行了回顾。
使用阳离子脂质体进行脂质体递送
工作原理:
DNA、siRNA 或寡核苷酸与转染试剂
(市售)在不同试管中进行稀释。
合并 DNA 与转染试剂以形成复合物。
阳离子脂质体上的正电荷与核酸上的磷酸盐骨架结合。
将复合物加入细胞中。阳离子脂质体上的正电荷有助于复合物与膜结合。
复合物通过内吞作用进入细胞。
对基因表达或沉默进行测定。
优点
商品化的产品,提供可重现的结果
适用于广泛的细胞系
高效率和表达性能
实验方案快速简单,无需更换培养基
缺点
可能需要优化 — 一些细胞系对阳离子脂质体较为敏感
一些细胞系不易使用阳离子脂质体进行转染
病毒递送
工作原理:
通过基因克隆、细胞培养、病毒分离以及克隆表征
生成重组病毒。
制备和纯化高滴度病毒载体。
以适当的感染复数 (MOI) 感染细胞(包含病毒受体)。
去除病毒和/或添加新鲜培养基。
对基因表达或沉默进行测定。
优点
对于难以转染的细胞类型效果良好
缺点
生成重组病毒在技术上具有挑战性且耗时
要转染的细胞系必须包含病毒受体
安全注意事项
通过电穿孔递送
工作原理:
让细胞悬浮于电穿孔缓冲液中,使其做好准备。
在专用缓冲液和 DNA 存在的情况下对细胞施以电脉冲。
电脉冲会在膜的两边形成电位差并引发
细胞膜临时穿孔,以便 DNA 进入
细胞恢复到生长条件。
对基因表达或沉默进行测定。
优点
对难以转染的细胞类型效果良好
缺点
需要仪器
需要优化电脉冲和场强参数
需要明显更多的细胞操作
可能观察到高毒性水平
可能对细胞膜造成不可逆的损伤并使细胞裂解
通过其他化学方法递送,即磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐、聚凝胺
工作原理:
制备溶液。混合氯化钙(在磷酸盐缓冲液中)和 DNA。
让含有浓缩 DNA 的极小不溶性微粒沉淀
CaPO
4
:在细胞培养物中加入复合物并孵育。
复合物粘附到细胞膜上,并通过内吞作用进入细胞质。
DEAE-右旋糖酐和聚凝胺:
使用 DMSO 或甘油通过渗透压休克法递送复合物。
带正电荷的聚合物复合物与带负电荷的 DNA 分子合力使复合物结合到细胞表面。
从细胞中去除复合物,洗涤,然后添加新鲜培养基。
对基因表达或沉默进行测定。
优点
试剂成本低廉
缺点
需要细心制备试剂 — CaPO
4
溶液对 pH 较为敏感
DEAE-右旋糖酐仅限于瞬时转染
细胞毒性
重现性可能有问题