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丁虎 博士，武汉同济医院讲师、主治医师
2000-2005年华中科技大学同济医学院临床医学本科；2005-2010年华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病学博士研究生。博士毕业后留同济医院心内科工作。主要从事心脑血管病新危险因素的研究，特别是遗传危险因素的研究。以第一作者和通信作者共发表SCI论文20篇，累计影响因子约80,总共被引用超过100次。目前主要研究方向：1.心脑血管病群体遗传学；2.流行病学和循证医学；3.基因诊断（包括个体化医疗；单基因病诊断；二代测序转化应用）。目前承担国家青年自然科学基金，国家863,973子课题，中国医师协会基金，新教授优秀青年基金，同济医院优秀青年基因各一项，总计180余万元。在遗传学研究平台基础上建立一系列新的基因诊断方法（包括基因分型指导华法林起始剂量等70余个单基因病的诊断和临床个体化医疗基因分型方法），促进最新的遗传学研究成果向临床转化和应用。其中4篇发表在美国心脏病协会(AHA)权威杂志上 (Circulation Research, Stroke 2篇, Circulation: Cardiovascular genetics)。分别获得2010年度裘法祖医学奖学金，2011年度湖北省优秀博士论文。
当初您是如何想到选择PGM应用于肥厚心肌病的测序？
丁虎：肥厚心肌病的的患者，除少数散发的，往往都有家族史，测序为预测疾病提供了技术手段。肥厚心肌病大概已知的500到700个突变位点，比较高效的测序方法是通过芯片，但是芯片主要应用于已知突变，对于未知突变很难实施检测。我们现在大家都知道的两个测序平台，一个就是Life Technology的Ion Torrent，另外一个就是Illumina的Miseq。使用PGM的过程中，我们在一天之内就可以得到一个稳定、可靠的报告。与一代测序相比，二代测序更为复杂一点。但实际上，做过一代测序的实验人员，进行二代测序是比较容易上手的，在我们实验室，一般学习周期也就是两天，然后就可以得到非常稳定、可靠、可重复的结果。这些都是我们最终选择PGM应用于临床基因诊断的原因。
在您的研究中，您既能够接触研究的对象，也能够接触PGM，那您有没有使用PGM让您觉得比较满意的，比较兴奋的例子呢？
丁虎：当然啦。我们曾对一个很大的家系进行研究，为肥厚心肌病找到一个突变的位点，这花费了我们大量的精力和时间——5到6万的经费，1到2个月的研究时间，以及大量的精力来分析得到结果。而使用PGM，我们当天就得到了这样一个结果，我们也没有过度地去分析它，计算机自动出报告，报告中指出了这个位点。以前，我们不敢确保得出结果所需要的时间，而现在通过PGM，我们可以很有信心确保在1到2天内得到结果。这些都是让我们很兴奋的地方。
您在使用PGM以后，在像“Stroke”这样的一线期刊上发表了文章。这种同行评定的期刊对数据的要求很高，您认为使用PGM产生的数据质量如何？
丁虎：在人类研究的话，PGM有非常强大的优势。首先是在于发现一些突变位点(尤其是SNP)，它发现的成功的概率远高于其它二代测序的平台，尤其是发现新的突变；另外，PGM系统的覆盖度更大一些，要高3%－5%，我们需要补漏、补洞的话，引物就会少一些，成功率会更高一些。最后对我们做人群分子研究来说意义重大的是，PGM系统所需要的DNA起始量仅仅10-20纳克，这可以帮助我们节约珍贵的样本，PGM或Proton体现出它巨大的优势。
您在研究当中采用了Ampliseq定制的一个试剂，能不能谈谈对定制试剂的使用心得？
丁虎：我应该说是在大中华区相对比较早的几个客户。区别于其它的系统，它是基于引物扩增来实现对信号的放大，理解起来容易，定制起来也非常容易。比如我们要做50个基因的话，通过网站，我们只需把50个基因的名字敲进去，就能得到我们所需要的东西，它的覆盖度都可以得到,非常容易上手。我们把基因提交给Illumina的话，比率会略低点。我们第一轮做的是1800个扩增子，以前要用一代测序做200个扩增子就非常了不起了。最后实际发现在1800对中，只有2-3对扩增子的coverage小于20，绝大部分引物都得到非常有效的扩增，因此这个基于PCR原理的扩增技术，应该是非常成熟的。
在您未来的计划当中，您对PGM还有没有什么期望或打算？
丁虎：我们主要是做人的单基因病或是遗传病的诊断，我想在未来应该有非常广泛的应用前景。有一些疾病，是同一个表型，但是由多个基因所决定，这在以前很难开展，费资耗力。很少有单位做这样的研究，现在，我们可以很自豪地说“我们可以做了”。未来如果有更大Proton P1和P2的芯片，扩张心肌病的测序就可以实现。这个Panel在未来临床基因诊断实验室，在遗传病、代谢领域、肿瘤领域、心血管领域，都可以广泛开展。
胡松年采访
胡松年 中科院北京基因组研究所研究员、博士生导师
主要从事基因组学、分子生物学及分子遗传学方面的研究。1996年于中国农业大学生物学院植物生化系获博士学位。1996-1998 年在中国医学科学院基础医学研究所任助研。1998-1999年在美国西雅图华盛顿大学基因组中心任访问学者。1999-2001年任中科院遗传所人类基因组中心暨北京华大基因研究中心总工程师。2002-2003年任杭州华大基因研发中心主任。2004年至今任中科院北京基因组研究所研究员。承担了多项国家863、973、国家自然科学基金等项目研究。参与了“人类基因组1%计划”、“家猪基因组计划”研究工作。并作为主要负责人之一承担了“水稻基因组计划”，并获“2002年度求是杰出科技成就集体奖”和“2003年度中国科学院杰出科技成就集体奖”。胡松年研究员在国内外重要学术刊物上共发表论文200余篇，发表专著《基因组数据分析手册》和《基因表达序列标签（EST）数据分析手册》2本，参与编著2本。近3年来利用高通量测序技术完成了超过10个全基因组测序细菌，构建完成一套基于高通量测序数据的基因组和转录组整合分析软件。
您认为PGM应用在细菌转录的实验当中发挥如何？
胡松年：我们为一个项目选择测序仪，最关键是这个机器本身的特征——它的通量、它的读长是否适合这个项目。PGM目前的芯片，从读长到通量，都非常适合一个细菌的转录组的产出，这也是我们选择PGM的原因。目前市场上测序仪的趋势是越来越大的通量产出，但是对一些比较急的项目，这需要花费更多的时间去凑齐样本，尤其是对细菌的项目。 而PGM从通量到读长，都可以满足细菌的转录组——不光是转录组，基因组的要求也可以满足。所以，从时间上和成本上，我们觉得PGM是比较合适的一个选择，特别适合无须高通量而要求时效性的项目。
您在PGM上获得了海量的数据，您认为这些数据有怎么样的特点？
胡松年： PGM的一个特点就是它更易读，就是说你拿到的都是直接可以看它的ACTG的一些东西，而且我觉得它更接近一代，就是所谓的Sanger法去做像3730那样读的东西，所以它有长，有短。那么这样来说，大家会对它的，包括它的软件等等，会对数据的形式会更熟悉一些。从数据质量来说，我觉得总体的质量还是很好的——而根据仪器的特点，我认为像Ion Torrent这个机器，应用在需要更高通量的，就是更高的测序深度的样本的话，可以获得更好的结果。
您在测序行业已经有20年的经验，经历了一代又一代的测序仪，您认为与以往的测序仪相比，Ion Torrent PGM有什么进步和突破吗？
胡松年：对我个人来说，最吸引我的一个就支持半导体的方式。每一台仪器都根据不同的原理设计。因此，对同样一段序列，不同的机器会表现出不同的性能。首先，Ion Torrent半导体检测的概念，这是物理性的新技术，让人充满期待，因为这可能会解决以前我们一直都在用化学法测序无法解决的问题。其次，PGM具备增长性，随着芯片不断推出，读长也会增加，产量也会提高。这两个机型其实一直给大家比较好的一个希望是说它会读到400，然后它以后会读到更长，所以就是公司的前瞻性。最后，我认为PGM结合其他机型，可以提供更多的选择。
您在今后还会把PGM运用于哪一些研究当中？
胡松年：有很多研究，我觉得PGM并没有因为Proton的推出而消失，这是很聪明的一个选择。一般的实验室，我如果需要很快地得到一个数据，我就用PGM；如果我需要测20个外显子组的测序，那么很显然，Proton就非常适合，一张芯片就是一个人的外显子的数据。在未来，我想还是根据项目特性选择，比如说细菌这一类的项目，我们会更偏重于用PGM；和人相关，或以后会有一些真菌这些项目的话，我们会更多的去使用Proton，根据项目的规模和特性进行匹配。
Ion Ampliseq：让基因检测服务于临床金域分子病理部赵薇薇主任专访
赵薇薇 金域医学检验分子病理部技术主任 美国分子病理学会（AMP ）会员, CAP 国际认证检查员
1984年毕业于北京大学生物系，1993到美国堪萨斯大学医学中心深造，2009年获得美国爱维拉大学医疗系统管理学硕士学位。2002年起任堪萨斯城儿童医院临床分子遗传诊断部主管，2010年加盟金域医学检验。金域检验是通过ISO15189及美国病理学会（CAP）认证的医学独立实验室，出具的检验报告在欧美等发达国家和地区均被认可。
您是如何看待分子诊断的现状？
赵薇薇：我参加国际会议的时候，会特别关注服务于临床领域的信息和发展，尤其是新的技术平台。为临床检测服务的平台需要具备一定的特性，如操作简便，像傻瓜机一样能够直接使用的产品还是非常有限的。我感觉Ion Torrent的Ampliseq比较适用于我们的需求，因为：首先是产品的套餐设定很符合临床检测的需求；其次就是操作的难易度，Ampliseq的技术平台学习周期比较短，对于没有NGS检测操作经验的人员来说也比较容易上手；再则，Ampliseq能够便捷地对数据做出分析；最后，Ampliseq的价格也在一个临床应用可以承受的范围内。
您认为Ampliseq的性能如何？
赵薇薇：在我们装机后方法验证的过程中用cancer panel做了21个以前我们用Sanger测序检测过的不同的肿瘤样本。除了得出与Sanger测序一致的结果外，我们还检测到其他的与病人的诊断，药物治疗，预后等相关的结果。也检测到Sanger测序法不能检测到的低频突变（low mutation frequency），等等。此外，时间也是一个重要的因素，患者需要根据我们的报告来制定治疗方案，我们需要在最快的时间内给病人结果。总之，Ampliseq为我们提供了高敏感度，高通量，高效率的检测手段。
您为什么对这个产品有如此的信心？
赵薇薇：到目前为止我们对比了21个不同病人的结果，包括一例CAP PT 结果，都很满意。用同样的成本，Sanger测序做一个肿瘤基因检测，Ampliseq可以做很多个。肿瘤病人的标本很珍贵，有时候我们做了一项基因检测后，医生需要加作检查其它项目，标本已经不够用了。而如果我们用10ng的DNA标本可以完成46个重要的肿瘤基因的检测的话，我相信这一定会对肿瘤病人的诊治起到积极的指导意义。
您对分子临床检测的前景如何看待？
赵薇薇：在美国包括Baylor医学院，MD Anderson肿瘤中心等国际领先的医疗机构都使用Ion Torrent的产品为肿瘤病人提供检测。我觉得我们在国内用Ampliseq做肿瘤基因检测还是非常超前的，可以站在这样一个前沿让我们非常骄傲。Ion Torrent Ampliseq非常适合肿瘤基因突变检测。对肿瘤的诊治，预后判断将是一个巨大的帮助。另外我们也在尝试Ampliseq自行设计套餐，我们根据不同的需要设计不同的检测项目组合。希望在不久的将来为不同的病人带来更有帮助的检测项目。
小成本，大数据——PGM在渔业研究中的应用
罗伟 华中农业大学博士生
主要从事鱼类分子遗传学和育种学研究。曾参加过大宗淡水鱼产业体系—团头鲂遗种质资源与育种、团头鲂HPG轴相关基因对其性早熟的分子调控研究和The population ecology and genetic diversity of endangered Tarim river system endemic fish Schizothorax biddulphi and its implications for conservation 等多个研究项目，具体研究内容涉及团头鲂SSR和SNP等分子标记的开发、基于SSR的团头鲂亲子鉴定平台构建、团头鲂SSR和SNP与生长相关性状的关联分析和团头鲂遗传力、配合力、杂交优势等方面的数量遗传学研究和裂腹鱼SSR开发及遗传资源评估。
您好，罗博士，首先能不能跟分享下您使用Ion Torrent PGM的经历？
罗伟：我们实验室是在2012年3月引进了PGM。在进行装机测序之后，我们在鱼类遗传育种以及渔业资源保护方面进行了很多项目的实验。我们做的第一个项目是新疆塔里木裂腹鱼的基因组测序，利用其中的序列查找微卫星，开发微卫星标记。另外，我们也对团头鲂的一部分基因组进行了测序。两者的转录组都只有几十兆的数据，所以我们用318的芯片来做。在后期，我们还将进行三角鲂大小群体的转录组的差异表达的基因测序，还要检测与生长或免疫相关的一些基因。另外，在育种方面，还涉及到细菌或是病毒的测序，比较典型的是我们进行了嗜水气单胞菌和鲤疱疹病毒的基因组测序。我们第一次做的PGM的通量有一个G左右，用的是318芯片。
到目前为止，您在PGM上面得到约一个G的数据。您对PGM所获取的数据感觉如何？
罗伟：我觉得在测序速度上，这个机器是无与伦比的——在没有技术支持并且还不是很熟悉的情况下，我自己一个人做，都可以在两天之内完成实验，而且还获得了比较好的数据。从样品准备到建库，到测序，到最后的数据分析，可以在两天到三天的时间内完成。我觉得在两三天内，花相对比较少的钱能够获得1G的数据，还是很令人满意的。这1G的数据，我们如果不做基因组分析，只为了获得一些序列来讲的话，这数据是足够的，足以帮助我们后续的完成。
您将PGM用在了渔业资源的研究方面，其实市面上有很多其他的测序仪，您的实验室为什么会选择PGM?
罗伟：我们主要关注于分子辅助育种和渔业资源，研究中我们要获得基因组的数据、转录组的数据，其中也包括很多分子标记，比如说微卫星标记，SNP标记，以及获得基因的一些扩增子表达或者序列。在对比了价格、操作等方面因素，我们选择了PGM。一个很重要的原因是，在我们后期做标记开发的时候，它有很强的针对性，特别是SNP，这就是比其他仪器更突出的地方。实际上，在渔业资源保护中，我们也是用到基因分子标记的方法在进行实验。在现有的条件下，我们没有选择其他的，就是通量更高的、数据量更大的测序平台。因为我们在目前PGM的使用情况下，可以完成实验，而且PGM在价格方面还是很有优势的。
您对PGM未来的应用有什么期待？您以后会不会把PGM用到其他的研究当中?
罗伟：有。主要是在鱼类疾病方面的一个应用。随着现在的集约化养殖和水质污染的情况日趋严重，鱼类的病害越来越多。病害不外乎是致病菌，病毒、细菌或者微生物。在病毒细菌基因组不是很大的情况下，PGM非常合适。我们之前进行了一个实验，对鲤鱼疱疹病毒的基因组进行测序。其中基因组的大小应该是70多K，我们用了1G的芯片获得了400到500多M的数据，所以覆盖度是完全没问题的,但花费是很节省的。在这么低成本的情况下，我们决定以后，在鱼类的病原细菌、病毒方面使用PGM进行更多的研究。
快速检测H7N9—PGM在病毒分型中的应用
赵翔: 疾病预防控制中心国家流感中心测序与新技术平台负责人
H7N9型禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现，并迅速在全国蔓延。截至2013年5月29日10时，全国已确诊131人，37人死亡。病例分布于北京、上海、江苏、浙江、安徽、山东、河南、台湾、福建等地。H7N9型禽流感因为是全球首次发现的新亚型流感病毒，因此尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，并且至2013年4月初尚未有疫苗推出。为了及时介入治疗，控制病情发展，并且迅速抑制传播，2013年5月，中国疾病预防控制中心果断选择试用新型的半导体高通量测序平台Ion torrent PGM 进行病毒分型。
请您为我们介绍一下您目前使用Ion PGM进行H7N9流感分型的经历和挑战？
赵翔: 好的。大家都知道现在在流感分型的领域，一代毛细管测序仪是金标准，因此我们决定对比ion PGM和CE的测序结果来进行初步验证。我们首先选用了两个人感染的样本做了检测。我们用Ion PGM，从样本制备到最终数据产出总共花了2天半到3天的时间。我们认为如果在时间非常紧迫的情况下，重新合理安排实验流程的话，理论上说其实24小时内就可以完成全部流程。速度非常快，而且结果跟一代毛细管测序仪的检测结果完全一致。因此我们当时感觉这确实是一个又快又准确的新型测序检测方法。
于是我们继续进行了更大样本量的测试。我们发现在一张PGM的芯片上，一次运行可以上很多个样本，这大大节约了时间，人力和财力。另外，用传统的方法，我们拿到病毒以后，为了能够拿到足量的DNA, 我们首先需要2-3天的增毒（生长流感病毒），然后设计了大量的引物，然后逐个筛选出工作最优的引物对进行测序，这个过程我们也大概花了4天的时间。但是现在我们用贵公司提供的PathAmpTM Flu A预扩增试剂盒进行前期的制备，可以免去了增毒和设计引物与优化引物的过程，特别在未知流感亚型的情况下大大节约了检测时间，这在流感爆发期是非常关键的。此外，PathAmpTM Flu A预扩增试剂盒与Ion PGM的整体解决方案，解决了环境样本的检测以及混合感染检测的难题。
另外，我觉得我们用高通量测序平台遇到的挑战就是后期的数据分析。我看到你们公司也提供了比较方便的流感分型的软件，但是我们可能需要更多的培训。
陈淑贞博士 副教授 长庚大学医学院生物医学科学系 长庚大学分子医学研究中心
陈淑贞博士目前任长庚大学副教授，并负责管理长庚大学分子医学研究中心的NGS核心设施。加入CGU之前，陈教授一直致力于生物技术行业，主要集中在研究肿瘤学和病毒学药物发现。她近期的工作重点为开发癌症诊断和治疗预测的生物标志物。
请问是基于什么原因，您的实验室选择了Ion Torrent PGM，而不是别的测序仪？
陈淑贞：在长庚的基因体中心现有的测序仪中， 我们认为在临床诊断的部门最合适的一个机器，其实就像Ion Torrent这样的机器。它的turn around很快，而且它的流程比较容易，所以它非常适合临床检验的单位。可以在很短的时间，用很少量病人的sample，可以在很快的时间就得到结果，那这其实是最主要的原因。
您能不能跟我们介绍一下，您已经用Ion Torrent有多长时间，然后在这个上面已经做了一些什么样的工作。那在这中间的话，你觉得Ion Torrent这个platform最优秀的特点是什么？
陈淑贞：我们长庚医学中心是在去年六月的时候开始正式使用Ion Torrent。到目前，我们已经在这个机器上面测序了大概将近五百个临床样本，主要是使用cancer panel，我们希望得到的结果可以帮助医生判断些病人的治疗方案。除了cancer panel的sequencing，我们也试着使用这个技术的高灵敏度来做一些比较特殊的样本的定序，那这个方向目前正在发展当中。
那您在这个应用Ion Torrent半年多，有什么感受呢？
陈淑贞：我想Ion的技术最大的特点是它突破了过去测序所需要很长时间的限制。并且它非常的有弹性。无论是当我们只有两三个样本，还是两三百个样本，都可以根据项目来制定计划，可以在很短的时间内做出研究。相比二代的那个定序则需要大量的样本，更长的时间。因此项目需要有很大的投资，才能开始。另外，我们感觉在过去这半年间，在样本制备的部分有非常多的突破。我们只需要很少量的样本，就可以去发展应用。甚至于我们把Ion这样的样本制备学到的经验，拿去应用在比如说像SOLiD 5500那样的sequencing。我们不但从Ion里面得到我们要的很多结果，我们还把其中的经验应用到其他测序，开拓更多的可能性。
在今后，您还会用Ion做些什么其他的工作呢？
陈淑贞：在未来的一年，我们希望，第一从我们过去已经得到的这些数据里面， 筛选到比较有重要性的基因，并且从过去半年的研究结果里面延伸。cancer panel的sequencing scope比较小，我们希望在未来的半年里，可以把它扩大。另外，我们有很多疾病模型，这些目前都还没有比较商业化的Panel，需要我们自己设计，为了将来后续的药物研发做准备。可以利用Ampliseq的技术，尝试一下是不是也可以在这上面可以很成功的测试出来。
丁虎 博士，武汉同济医院讲师、主治医师
2000-2005年华中科技大学同济医学院临床医学本科；2005-2010年华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病学博士研究生。博士毕业后留同济医院心内科工作。主要从事心脑血管病新危险因素的研究，特别是遗传危险因素的研究。以第一作者和通信作者共发表SCI论文20篇，累计影响因子约80,总共被引用超过100次。目前主要研究方向：1.心脑血管病群体遗传学；2.流行病学和循证医学；3.基因诊断（包括个体化医疗；单基因病诊断；二代测序转化应用）。目前承担国家青年自然科学基金，国家863,973子课题，中国医师协会基金，新教授优秀青年基金，同济医院优秀青年基因各一项，总计180余万元。在遗传学研究平台基础上建立一系列新的基因诊断方法（包括基因分型指导华法林起始剂量等70余个单基因病的诊断和临床个体化医疗基因分型方法），促进最新的遗传学研究成果向临床转化和应用。其中4篇发表在美国心脏病协会(AHA)权威杂志上 (Circulation Research, Stroke 2篇, Circulation: Cardiovascular genetics)。分别获得2010年度裘法祖医学奖学金，2011年度湖北省优秀博士论文。
当初您是如何想到选择PGM应用于肥厚心肌病的测序？
丁虎：肥厚心肌病的的患者，除少数散发的，往往都有家族史，测序为预测疾病提供了技术手段。肥厚心肌病大概已知的500到700个突变位点，比较高效的测序方法是通过芯片，但是芯片主要应用于已知突变，对于未知突变很难实施检测。我们现在大家都知道的两个测序平台，一个就是Life Technology的Ion Torrent，另外一个就是Illumina的Miseq。使用PGM的过程中，我们在一天之内就可以得到一个稳定、可靠的报告。与一代测序相比，二代测序更为复杂一点。但实际上，做过一代测序的实验人员，进行二代测序是比较容易上手的，在我们实验室，一般学习周期也就是两天，然后就可以得到非常稳定、可靠、可重复的结果。这些都是我们最终选择PGM应用于临床基因诊断的原因。
在您的研究中，您既能够接触研究的对象，也能够接触PGM，那您有没有使用PGM让您觉得比较满意的，比较兴奋的例子呢？
丁虎：当然啦。我们曾对一个很大的家系进行研究，为肥厚心肌病找到一个突变的位点，这花费了我们大量的精力和时间——5到6万的经费，1到2个月的研究时间，以及大量的精力来分析得到结果。而使用PGM，我们当天就得到了这样一个结果，我们也没有过度地去分析它，计算机自动出报告，报告中指出了这个位点。以前，我们不敢确保得出结果所需要的时间，而现在通过PGM，我们可以很有信心确保在1到2天内得到结果。这些都是让我们很兴奋的地方。
您在使用PGM以后，在像“Stroke”这样的一线期刊上发表了文章。这种同行评定的期刊对数据的要求很高，您认为使用PGM产生的数据质量如何？
丁虎：在人类研究的话，PGM有非常强大的优势。首先是在于发现一些突变位点(尤其是SNP)，它发现的成功的概率远高于其它二代测序的平台，尤其是发现新的突变；另外，PGM系统的覆盖度更大一些，要高3%－5%，我们需要补漏、补洞的话，引物就会少一些，成功率会更高一些。最后对我们做人群分子研究来说意义重大的是，PGM系统所需要的DNA起始量仅仅10-20纳克，这可以帮助我们节约珍贵的样本，PGM或Proton体现出它巨大的优势。
您在研究当中采用了Ampliseq定制的一个试剂，能不能谈谈对定制试剂的使用心得？
丁虎：我应该说是在大中华区相对比较早的几个客户。区别于其它的系统，它是基于引物扩增来实现对信号的放大，理解起来容易，定制起来也非常容易。比如我们要做50个基因的话，通过网站，我们只需把50个基因的名字敲进去，就能得到我们所需要的东西，它的覆盖度都可以得到,非常容易上手。我们把基因提交给Illumina的话，比率会略低点。我们第一轮做的是1800个扩增子，以前要用一代测序做200个扩增子就非常了不起了。最后实际发现在1800对中，只有2-3对扩增子的coverage小于20，绝大部分引物都得到非常有效的扩增，因此这个基于PCR原理的扩增技术，应该是非常成熟的。
在您未来的计划当中，您对PGM还有没有什么期望或打算？
丁虎：我们主要是做人的单基因病或是遗传病的诊断，我想在未来应该有非常广泛的应用前景。有一些疾病，是同一个表型，但是由多个基因所决定，这在以前很难开展，费资耗力。很少有单位做这样的研究，现在，我们可以很自豪地说“我们可以做了”。未来如果有更大Proton P1和P2的芯片，扩张心肌病的测序就可以实现。这个Panel在未来临床基因诊断实验室，在遗传病、代谢领域、肿瘤领域、心血管领域，都可以广泛开展。
胡松年采访
胡松年 中科院北京基因组研究所研究员、博士生导师
主要从事基因组学、分子生物学及分子遗传学方面的研究。1996年于中国农业大学生物学院植物生化系获博士学位。1996-1998 年在中国医学科学院基础医学研究所任助研。1998-1999年在美国西雅图华盛顿大学基因组中心任访问学者。1999-2001年任中科院遗传所人类基因组中心暨北京华大基因研究中心总工程师。2002-2003年任杭州华大基因研发中心主任。2004年至今任中科院北京基因组研究所研究员。承担了多项国家863、973、国家自然科学基金等项目研究。参与了“人类基因组1%计划”、“家猪基因组计划”研究工作。并作为主要负责人之一承担了“水稻基因组计划”，并获“2002年度求是杰出科技成就集体奖”和“2003年度中国科学院杰出科技成就集体奖”。胡松年研究员在国内外重要学术刊物上共发表论文200余篇，发表专著《基因组数据分析手册》和《基因表达序列标签（EST）数据分析手册》2本，参与编著2本。近3年来利用高通量测序技术完成了超过10个全基因组测序细菌，构建完成一套基于高通量测序数据的基因组和转录组整合分析软件。
您认为PGM应用在细菌转录的实验当中发挥如何？
胡松年：我们为一个项目选择测序仪，最关键是这个机器本身的特征——它的通量、它的读长是否适合这个项目。PGM目前的芯片，从读长到通量，都非常适合一个细菌的转录组的产出，这也是我们选择PGM的原因。目前市场上测序仪的趋势是越来越大的通量产出，但是对一些比较急的项目，这需要花费更多的时间去凑齐样本，尤其是对细菌的项目。 而PGM从通量到读长，都可以满足细菌的转录组——不光是转录组，基因组的要求也可以满足。所以，从时间上和成本上，我们觉得PGM是比较合适的一个选择，特别适合无须高通量而要求时效性的项目。
您在PGM上获得了海量的数据，您认为这些数据有怎么样的特点？
胡松年： PGM的一个特点就是它更易读，就是说你拿到的都是直接可以看它的ACTG的一些东西，而且我觉得它更接近一代，就是所谓的Sanger法去做像3730那样读的东西，所以它有长，有短。那么这样来说，大家会对它的，包括它的软件等等，会对数据的形式会更熟悉一些。从数据质量来说，我觉得总体的质量还是很好的——而根据仪器的特点，我认为像Ion Torrent这个机器，应用在需要更高通量的，就是更高的测序深度的样本的话，可以获得更好的结果。
您在测序行业已经有20年的经验，经历了一代又一代的测序仪，您认为与以往的测序仪相比，Ion Torrent PGM有什么进步和突破吗？
胡松年：对我个人来说，最吸引我的一个就支持半导体的方式。每一台仪器都根据不同的原理设计。因此，对同样一段序列，不同的机器会表现出不同的性能。首先，Ion Torrent半导体检测的概念，这是物理性的新技术，让人充满期待，因为这可能会解决以前我们一直都在用化学法测序无法解决的问题。其次，PGM具备增长性，随着芯片不断推出，读长也会增加，产量也会提高。这两个机型其实一直给大家比较好的一个希望是说它会读到400，然后它以后会读到更长，所以就是公司的前瞻性。最后，我认为PGM结合其他机型，可以提供更多的选择。
您在今后还会把PGM运用于哪一些研究当中？
胡松年：有很多研究，我觉得PGM并没有因为Proton的推出而消失，这是很聪明的一个选择。一般的实验室，我如果需要很快地得到一个数据，我就用PGM；如果我需要测20个外显子组的测序，那么很显然，Proton就非常适合，一张芯片就是一个人的外显子的数据。在未来，我想还是根据项目特性选择，比如说细菌这一类的项目，我们会更偏重于用PGM；和人相关，或以后会有一些真菌这些项目的话，我们会更多的去使用Proton，根据项目的规模和特性进行匹配。
Ion Ampliseq：让基因检测服务于临床金域分子病理部赵薇薇主任专访
赵薇薇 金域医学检验分子病理部技术主任 美国分子病理学会（AMP ）会员, CAP 国际认证检查员
1984年毕业于北京大学生物系，1993到美国堪萨斯大学医学中心深造，2009年获得美国爱维拉大学医疗系统管理学硕士学位。2002年起任堪萨斯城儿童医院临床分子遗传诊断部主管，2010年加盟金域医学检验。金域检验是通过ISO15189及美国病理学会（CAP）认证的医学独立实验室，出具的检验报告在欧美等发达国家和地区均被认可。
您是如何看待分子诊断的现状？
赵薇薇：我参加国际会议的时候，会特别关注服务于临床领域的信息和发展，尤其是新的技术平台。为临床检测服务的平台需要具备一定的特性，如操作简便，像傻瓜机一样能够直接使用的产品还是非常有限的。我感觉Ion Torrent的Ampliseq比较适用于我们的需求，因为：首先是产品的套餐设定很符合临床检测的需求；其次就是操作的难易度，Ampliseq的技术平台学习周期比较短，对于没有NGS检测操作经验的人员来说也比较容易上手；再则，Ampliseq能够便捷地对数据做出分析；最后，Ampliseq的价格也在一个临床应用可以承受的范围内。
您认为Ampliseq的性能如何？
赵薇薇：在我们装机后方法验证的过程中用cancer panel做了21个以前我们用Sanger测序检测过的不同的肿瘤样本。除了得出与Sanger测序一致的结果外，我们还检测到其他的与病人的诊断，药物治疗，预后等相关的结果。也检测到Sanger测序法不能检测到的低频突变（low mutation frequency），等等。此外，时间也是一个重要的因素，患者需要根据我们的报告来制定治疗方案，我们需要在最快的时间内给病人结果。总之，Ampliseq为我们提供了高敏感度，高通量，高效率的检测手段。
您为什么对这个产品有如此的信心？
赵薇薇：到目前为止我们对比了21个不同病人的结果，包括一例CAP PT 结果，都很满意。用同样的成本，Sanger测序做一个肿瘤基因检测，Ampliseq可以做很多个。肿瘤病人的标本很珍贵，有时候我们做了一项基因检测后，医生需要加作检查其它项目，标本已经不够用了。而如果我们用10ng的DNA标本可以完成46个重要的肿瘤基因的检测的话，我相信这一定会对肿瘤病人的诊治起到积极的指导意义。
您对分子临床检测的前景如何看待？
赵薇薇：在美国包括Baylor医学院，MD Anderson肿瘤中心等国际领先的医疗机构都使用Ion Torrent的产品为肿瘤病人提供检测。我觉得我们在国内用Ampliseq做肿瘤基因检测还是非常超前的，可以站在这样一个前沿让我们非常骄傲。Ion Torrent Ampliseq非常适合肿瘤基因突变检测。对肿瘤的诊治，预后判断将是一个巨大的帮助。另外我们也在尝试Ampliseq自行设计套餐，我们根据不同的需要设计不同的检测项目组合。希望在不久的将来为不同的病人带来更有帮助的检测项目。
小成本，大数据——PGM在渔业研究中的应用
罗伟 华中农业大学博士生
主要从事鱼类分子遗传学和育种学研究。曾参加过大宗淡水鱼产业体系—团头鲂遗种质资源与育种、团头鲂HPG轴相关基因对其性早熟的分子调控研究和The population ecology and genetic diversity of endangered Tarim river system endemic fish Schizothorax biddulphi and its implications for conservation 等多个研究项目，具体研究内容涉及团头鲂SSR和SNP等分子标记的开发、基于SSR的团头鲂亲子鉴定平台构建、团头鲂SSR和SNP与生长相关性状的关联分析和团头鲂遗传力、配合力、杂交优势等方面的数量遗传学研究和裂腹鱼SSR开发及遗传资源评估。
您好，罗博士，首先能不能跟分享下您使用Ion Torrent PGM的经历？
罗伟：我们实验室是在2012年3月引进了PGM。在进行装机测序之后，我们在鱼类遗传育种以及渔业资源保护方面进行了很多项目的实验。我们做的第一个项目是新疆塔里木裂腹鱼的基因组测序，利用其中的序列查找微卫星，开发微卫星标记。另外，我们也对团头鲂的一部分基因组进行了测序。两者的转录组都只有几十兆的数据，所以我们用318的芯片来做。在后期，我们还将进行三角鲂大小群体的转录组的差异表达的基因测序，还要检测与生长或免疫相关的一些基因。另外，在育种方面，还涉及到细菌或是病毒的测序，比较典型的是我们进行了嗜水气单胞菌和鲤疱疹病毒的基因组测序。我们第一次做的PGM的通量有一个G左右，用的是318芯片。
到目前为止，您在PGM上面得到约一个G的数据。您对PGM所获取的数据感觉如何？
罗伟：我觉得在测序速度上，这个机器是无与伦比的——在没有技术支持并且还不是很熟悉的情况下，我自己一个人做，都可以在两天之内完成实验，而且还获得了比较好的数据。从样品准备到建库，到测序，到最后的数据分析，可以在两天到三天的时间内完成。我觉得在两三天内，花相对比较少的钱能够获得1G的数据，还是很令人满意的。这1G的数据，我们如果不做基因组分析，只为了获得一些序列来讲的话，这数据是足够的，足以帮助我们后续的完成。
您将PGM用在了渔业资源的研究方面，其实市面上有很多其他的测序仪，您的实验室为什么会选择PGM?
罗伟：我们主要关注于分子辅助育种和渔业资源，研究中我们要获得基因组的数据、转录组的数据，其中也包括很多分子标记，比如说微卫星标记，SNP标记，以及获得基因的一些扩增子表达或者序列。在对比了价格、操作等方面因素，我们选择了PGM。一个很重要的原因是，在我们后期做标记开发的时候，它有很强的针对性，特别是SNP，这就是比其他仪器更突出的地方。实际上，在渔业资源保护中，我们也是用到基因分子标记的方法在进行实验。在现有的条件下，我们没有选择其他的，就是通量更高的、数据量更大的测序平台。因为我们在目前PGM的使用情况下，可以完成实验，而且PGM在价格方面还是很有优势的。
您对PGM未来的应用有什么期待？您以后会不会把PGM用到其他的研究当中?
罗伟：有。主要是在鱼类疾病方面的一个应用。随着现在的集约化养殖和水质污染的情况日趋严重，鱼类的病害越来越多。病害不外乎是致病菌，病毒、细菌或者微生物。在病毒细菌基因组不是很大的情况下，PGM非常合适。我们之前进行了一个实验，对鲤鱼疱疹病毒的基因组进行测序。其中基因组的大小应该是70多K，我们用了1G的芯片获得了400到500多M的数据，所以覆盖度是完全没问题的,但花费是很节省的。在这么低成本的情况下，我们决定以后，在鱼类的病原细菌、病毒方面使用PGM进行更多的研究。
快速检测H7N9—PGM在病毒分型中的应用
赵翔: 疾病预防控制中心国家流感中心测序与新技术平台负责人
H7N9型禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现，并迅速在全国蔓延。截至2013年5月29日10时，全国已确诊131人，37人死亡。病例分布于北京、上海、江苏、浙江、安徽、山东、河南、台湾、福建等地。H7N9型禽流感因为是全球首次发现的新亚型流感病毒，因此尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，并且至2013年4月初尚未有疫苗推出。为了及时介入治疗，控制病情发展，并且迅速抑制传播，2013年5月，中国疾病预防控制中心果断选择试用新型的半导体高通量测序平台Ion torrent PGM 进行病毒分型。
请您为我们介绍一下您目前使用Ion PGM进行H7N9流感分型的经历和挑战？
赵翔: 好的。大家都知道现在在流感分型的领域，一代毛细管测序仪是金标准，因此我们决定对比ion PGM和CE的测序结果来进行初步验证。我们首先选用了两个人感染的样本做了检测。我们用Ion PGM，从样本制备到最终数据产出总共花了2天半到3天的时间。我们认为如果在时间非常紧迫的情况下，重新合理安排实验流程的话，理论上说其实24小时内就可以完成全部流程。速度非常快，而且结果跟一代毛细管测序仪的检测结果完全一致。因此我们当时感觉这确实是一个又快又准确的新型测序检测方法。
于是我们继续进行了更大样本量的测试。我们发现在一张PGM的芯片上，一次运行可以上很多个样本，这大大节约了时间，人力和财力。另外，用传统的方法，我们拿到病毒以后，为了能够拿到足量的DNA, 我们首先需要2-3天的增毒（生长流感病毒），然后设计了大量的引物，然后逐个筛选出工作最优的引物对进行测序，这个过程我们也大概花了4天的时间。但是现在我们用贵公司提供的PathAmpTM Flu A预扩增试剂盒进行前期的制备，可以免去了增毒和设计引物与优化引物的过程，特别在未知流感亚型的情况下大大节约了检测时间，这在流感爆发期是非常关键的。此外，PathAmpTM Flu A预扩增试剂盒与Ion PGM的整体解决方案，解决了环境样本的检测以及混合感染检测的难题。
另外，我觉得我们用高通量测序平台遇到的挑战就是后期的数据分析。我看到你们公司也提供了比较方便的流感分型的软件，但是我们可能需要更多的培训。
陈淑贞博士 副教授 长庚大学医学院生物医学科学系 长庚大学分子医学研究中心
陈淑贞博士目前任长庚大学副教授，并负责管理长庚大学分子医学研究中心的NGS核心设施。加入CGU之前，陈教授一直致力于生物技术行业，主要集中在研究肿瘤学和病毒学药物发现。她近期的工作重点为开发癌症诊断和治疗预测的生物标志物。
请问是基于什么原因，您的实验室选择了Ion Torrent PGM，而不是别的测序仪？
陈淑贞：在长庚的基因体中心现有的测序仪中， 我们认为在临床诊断的部门最合适的一个机器，其实就像Ion Torrent这样的机器。它的turn around很快，而且它的流程比较容易，所以它非常适合临床检验的单位。可以在很短的时间，用很少量病人的sample，可以在很快的时间就得到结果，那这其实是最主要的原因。
您能不能跟我们介绍一下，您已经用Ion Torrent有多长时间，然后在这个上面已经做了一些什么样的工作。那在这中间的话，你觉得Ion Torrent这个platform最优秀的特点是什么？
陈淑贞：我们长庚医学中心是在去年六月的时候开始正式使用Ion Torrent。到目前，我们已经在这个机器上面测序了大概将近五百个临床样本，主要是使用cancer panel，我们希望得到的结果可以帮助医生判断些病人的治疗方案。除了cancer panel的sequencing，我们也试着使用这个技术的高灵敏度来做一些比较特殊的样本的定序，那这个方向目前正在发展当中。
那您在这个应用Ion Torrent半年多，有什么感受呢？
陈淑贞：我想Ion的技术最大的特点是它突破了过去测序所需要很长时间的限制。并且它非常的有弹性。无论是当我们只有两三个样本，还是两三百个样本，都可以根据项目来制定计划，可以在很短的时间内做出研究。相比二代的那个定序则需要大量的样本，更长的时间。因此项目需要有很大的投资，才能开始。另外，我们感觉在过去这半年间，在样本制备的部分有非常多的突破。我们只需要很少量的样本，就可以去发展应用。甚至于我们把Ion这样的样本制备学到的经验，拿去应用在比如说像SOLiD 5500那样的sequencing。我们不但从Ion里面得到我们要的很多结果，我们还把其中的经验应用到其他测序，开拓更多的可能性。
在今后，您还会用Ion做些什么其他的工作呢？
陈淑贞：在未来的一年，我们希望，第一从我们过去已经得到的这些数据里面， 筛选到比较有重要性的基因，并且从过去半年的研究结果里面延伸。cancer panel的sequencing scope比较小，我们希望在未来的半年里，可以把它扩大。另外，我们有很多疾病模型，这些目前都还没有比较商业化的Panel，需要我们自己设计，为了将来后续的药物研发做准备。可以利用Ampliseq的技术，尝试一下是不是也可以在这上面可以很成功的测试出来。