LC-MS样品制备

液相色谱质谱样品制备

液相色谱-质谱联用技术（LC/MS）适用于热不稳定、大分子、极性、离子性或非挥发性样品，也适用于需进行衍生化处理的样品。典型的 LC/MS 分析样品包括核苷酸、肽类、类固醇、激素、染料、脂肪酸和醇类。因此，LC/MS 常用于药代动力学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学和药物开发。

首先使用液相色谱分离样品组分，使其以相对纯化的形式进入质谱仪进行分析。通常采用电喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI）将样品转化为带电离子，正是这些离子进入质谱分析仪进行分析。通过将目标离子的质量电荷比（m/z）与谱图库（例如 MassBank、METLIN 和 mzCloud）进行比对，来确定其身份。

LC/MS 与 GC/MS 在某些方面有重叠，LC/MS 的某些样品类型有时也可用 GC/MS 分析，示意如图所示：

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Figure 1. Samples can be separated and analyzed by either GC/MS, LC/MS, or both GC/MS and LC/MS.

液相色谱质谱样品制备

含有非挥发性或大分子化合物的 LC/MS 样品，通常先经过液相色谱（LC）分离后，再进行质谱（MS）分析。这是在数百甚至数千种其他化合物和污染物中最终分离并鉴定目标分析物的必要步骤。

与早期的重力流柱不同，现代的 LC色谱柱填充了密集的细颗粒固定相，分析物分离只能在高压（HPLC）或超高压液相色谱（UHPLC）条件下实现。色谱技术的这一进步，使仅相差几个道尔顿的分子也能够实现分离。这也促使色谱分析人员开发样品前处理方法，以实现更快速、更洁净的液相色谱分析。

样品的物理和化学特性对确定其如何消解并进行液相色谱前处理至关重要。过滤通常用于含有颗粒物的样品，例如未溶解的盐类，许多实验室使用疏水性或亲水性PTFE过滤器去除干扰物质和细小颗粒。

从物理性质来看，需要考虑分析物的尺寸，这将决定所用色谱柱填料的孔径和粒径。从化学性质来看，必须考虑分析物的pH，因为它决定了色谱柱填料中所使用的键合相类型（例如烷基键合基团）。此外，不同的色谱柱适用于不同的样品pH范围。

完整的LC/MS样品前处理必须同时考虑流动相（含分析物）和固定相（填料或载体）。还应考虑可溶和不溶基质组分，以及它们是否会干扰分析物从色谱柱的最终洗脱。

几乎不言而喻，制备流动相时应始终使用最高纯度的水、溶剂和缓冲液，因为这些组分都会增加背景噪音。如果质谱图存在较高的背景噪声，检测限和定量限将受到影响。

样品如何进行前处理，以便进样至液相色谱-质谱联用系统（LC/MS）?

固相萃取（SPE）：该分离技术常用于分离溶液（例如水）中溶解的化合物（例如农药）。萃取小柱中填充十八烷基（C-18）固定相（可基于硅胶），溶液通过该色谱柱流过。或者，如果样品高度酸性，可使用聚合物基质萃取小柱。

Figure 2. Solid phase extraction can be performed using standard columns or SOLAµ 96-well plates.

各个化合物随时间逐步洗脱，一个SPE小柱最终可洗脱出多种化合物。洗脱液可浓缩至干后，用50:50（体积比，甲醇/水）溶液重溶，并进样至质谱仪进行分析。另外，SPE也可在高通量96孔板上进行，例如 SOLAµ SPE 板。

液液萃取（LLE）：在LLE中，目标分析物先由溶剂进行分配，然后被萃取、浓缩并稀释。酚-氯仿萃取是LLE的一个示例，过去常用于分离蛋白质，也用于分离核酸。以测定特定分析物（例如睾酮）为例，先向样品中加入有机溶剂甲基叔丁基醚，然后进行涡旋混合。然后取出上清液，并转移至加热模块中。蒸发后，将残留物用含醋酸铵和甲酸的50:50甲醇/水溶液重溶。

固相支持液液萃取 (SLE): 在SLE中，将水性样品加载到由硅藻土组成的载体上。样品被吸附于载体上，随后用有机萃取溶剂（如甲基叔丁基醚）洗涤数次。分析物分配到有机相后，先通过干燥将其浓缩，然后在50:50（体积比，甲醇/水）溶液中复溶。

蛋白沉淀 (PPE): 存在多种蛋白沉淀方法，包括脱盐、等电点沉淀、有机溶剂萃取和离子交换。所用的具体色谱方法取决于样品类型（细胞、组织或体液）、目标蛋白的位置、丰度和分子量、基质效应等因素。

脱盐: 也称为硫酸铵沉淀。这种蛋白沉淀技术通过逐步提高硫酸铵浓度，直到蛋白发生“盐析”来实现。随着盐浓度增加，盐分最终在可用水分子上取得优势，从而使蛋白质从溶液中析出。

等电点沉淀: 蛋白质的溶解度受其离子强度（pH）影响；例如当溶剂降低离子强度或改变环境时，使蛋白质达到等电点并呈现净电荷为零时，蛋白质倾向于聚集并形成沉淀。

Figure 3. A protein can bind to either a cationic or anionic column, and then be induced to precipitate upon reaching its unique isoelectric point.

有机溶剂萃取：蛋白的溶解度通常依赖于较大介电常数的环境，这种环境存在于像水这样的溶剂中。而像丙酮和甲醇这样的有机溶剂具有较低的介电常数，因此更易促使蛋白质聚集，便于进行质谱分析。

在有机溶剂萃取过程中，由于蛋白在水与有机溶剂中的溶解度不同，目标蛋白会发生沉淀。在沉淀和浓缩之后，加入缓冲溶液以优化溶液的 pH 值。随后使用如乙醚或氯仿等溶剂萃取目标蛋白。

离子交换色谱：当溶剂萃取因乳化而受阻时，可采用此技术。其原理是利用蛋白质不同的等电点，使其在相应条件下被“截留”或分离。离子交换柱使用聚合材料（例如阴离子交换树脂 DEAE 纤维素）和不同溶液来建立 pH 梯度。蛋白质在该 pH 梯度中迁移，直至达到其等电点，此时迁移停止。通过改变洗脱缓冲液的 pH 或提高洗脱缓冲液的盐浓度，可以将结合的蛋白洗脱下来。

通过 LC/MS 常规分析的特定分析物具有各自独特的前处理流程，概述如下：

农药样品制备
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医药与生物制药样品制备
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液相色谱柱概述

Figure 4. Silica surface silanol groups
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液相色谱柱通常以 HPLC 和 UHPLC 两种规格提供。有关色谱柱的更多信息，请参见我们的色谱学习中心。

The columns themselves consist of two parts: the support matrix (often composed of silica) and the bonded 色谱柱本体通常由两部分组成：载体基质（通常由硅胶构成）和键合相（附着在硅胶上的化学基团）。载体基质的差异决定了酸性或碱性分析物是否会通过与不同键合基团的相互作用而被色谱柱保留。下图展示了一个硅醇键合基团的示例。

下列材料常用于色谱柱的载体基质：

单体硅胶：常用于食品、血浆、黏稠样品或“脏”样品的前处理。该材料含有直径≥50 nm 的大孔以及直径2–50 nm 的小孔。该材料为单块可渗透整体，而非由单个颗粒组成(1)。这种整体结构中不同孔径范围的存在，使得样品在低背压条件下仍能实现快速分析。单体硅胶常用于分离大分子。
Core-shell: 这种载体材料也称为实心核颗粒，由一个实心的硅胶芯包覆多孔壳层组成。与单体硅胶相比，颗粒直径的分布更窄，因此色谱分离更快、效率更高。

Figure 5. A solid silica core surrounded by porous shell material enables fast chromatography separations when using core-shell-based columns.

传统硅胶：也称为全孔硅胶，传统硅胶柱具有较大的比表面积和高机械强度；此类色谱柱常用于极性样品，并能耐受高背压。尽管传统硅胶在高 pH 条件下（> pH 7.5）易发生水解，但可通过引入有机基团进行改性，形成有机硅杂化材料。传统硅胶也可被改性，并作为反相液相色谱（RPLC）的载体材料。
多孔石墨化碳：由按六角形排列的碳原子构成的平面片层组成，多孔石墨化碳不含相互作用的硅醇基团，可用于在极端 pH 条件下分离样品。多孔石墨化碳常用于反相液相色谱（RPLC）和亲水相互作用色谱（HILIC）。
HILIC 模式分离使用乙腈，并加入少量水或醇类，从而形成一种液/液萃取体系。也可加入如高氯酸钠等盐类，以增强洗脱能力。HILIC 模式常用于代谢组学和糖基化研究。

References