细胞计数是当今细胞生物学及相关研究的基石，无论是科学家进行常规细胞培养中的细胞分盘，还是为下游实验准备细胞样本。准确的细胞计数和细胞活力测定可通过多种方法实现，包括使用血细胞计数板和显微镜进行手动计数，或使用流式细胞仪等复杂仪器。还有许多其他自动细胞计数选项，例如 Invitrogen™ Countess™ 3 和 Countess™ 3 FL 自动细胞计数仪。

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细胞计数板的计数方法

样本制备

准确的细胞计数始于扎实的样本制备基础。最佳的样本制备可分为两个阶段。第一阶段需要完成一系列步骤以制备目标样本，通常为较大体积，以便进一步处理用于下游用途。第二阶段则是对第一阶段制备的样本进行计数前的处理。这些步骤可能因样本来源（如永生化悬浮细胞系、贴壁细胞系、冻存样本或原代细胞样本）而有显著差异。

第一阶段的步骤高度依赖于样本类型和下游应用。然而，细胞计数样本制备中的细节至关重要。以下是三大关键建议（图1）。

  • 制备均匀的细胞悬液——不要涡旋细胞样本。通过轻柔但充分的移液、倒置或手指轻弹混匀，然后立即从母样本中取出等分试样。若样本静置后再移液，可能导致浓度梯度的形成，从而造成计数结果不一致。
  • 避免引入碎片——不要涡旋台盼蓝溶液。即使是新开封的台盼蓝溶液，也常含有细小颗粒物。这些颗粒会 passively 积聚在管底，避免混匀和涡旋可使大部分溶液保持清洁可用。切勿冷冻台盼蓝溶液，否则会显著增加沉淀量。
  • 实现统一的焦平面——将细胞样本（10 µL）与台盼蓝溶液（10 µL）混合后，取 10 µL 染色细胞悬液加入计数室。静置约 30 秒，以确保细胞沉降到统一的焦平面。
细胞计数样本制备三大关键建议（A–C）

（A 充分混匀细胞以制备均匀的细胞悬液。B 不要混匀或涡旋台盼蓝溶液；从管顶部吸取溶液。C 留出时间让细胞沉降到焦平面。血细胞计数板（侧视图），样本，盖玻片，计数平台）

图1. 为细胞计数准备样本的三大关键建议（A–C）。

仪器设置

无论您使用的是Countess 细胞计数仪、其他自动细胞计数仪，还是显微镜和血细胞计数板，仪器设置对于实现准确且一致的计数结果至关重要。以下是实现准确细胞计数的三大关键仪器设置。图2展示了其中两项设置对准确性和精密性的影响。

  • 均匀、一致的照明
  • 正确的焦距
  • 一致的阈值设定（手动计数无法实现）

使用 Countess 3 或 Countess 3 FL 仪器时，建议选择默认仪器配置，以确保所有阈值设定在细胞计数开始时已优化。Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器配备自动对焦和自动照明功能，可为每个样本优化焦距和照明，从而减少可能影响计数结果的变异性。图3展示了人和小鼠外周血单个核细胞（PBMC）样本在均匀照明和对焦下的计数效果。这些原代样本中几乎没有 PBMC 制备中常见的小颗粒或其他碎片。对于早期的 Invitrogen™ Countess™ 仪器，通常建议通过阈值设定排除小颗粒以减少碎片对计数准确性的影响（图4）。而 Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器凭借基于人工智能（AI）的先进对焦和图像分析算法，基本无需阈值设定。此外，用户仍可根据需求调整大小、亮度和圆度等参数。

Countess 3 细胞计数仪的细胞圈出性能在明场图像中的展示

图2. Countess 3 细胞计数仪的细胞圈出性能在明场图像中的展示。

A. 人PBMCs

成功计数两种外周血单个核细胞（PBMC）样本：（A）人

B. 小鼠PBMCs

成功计数两种外周血单个核细胞（PBMC）样本：（B）小鼠

图3. 成功计数两种外周血单个核细胞（PBMC）样本：（A）人和（B）小鼠。 得益于均匀的照明、对焦和染色，且几乎没有碎片，细胞计数高效完成。使用 Countess 3 自动细胞计数仪的默认设置获得这些结果。

A

使用 Countess II 时，大量小颗粒被计数，因此需要通过阈值设定排除

B

使用 Countess 3 时，小颗粒未被计入，无需阈值设定

C

红色箭头表示原代细胞样本中常见的小颗粒及台盼蓝溶液沉淀导致的颗粒

图4. 使用 Invitrogen™ Countess™ II 和 Countess 3 细胞计数仪在默认设置下的计数结果对比。 （A）使用 Countess II 时，大量小颗粒被计数，因此需要通过阈值设定排除。（B）使用 Countess 3 时，小颗粒未被计入，无需阈值设定。（C）红色箭头表示原代细胞样本中常见的小颗粒及台盼蓝溶液沉淀导致的颗粒。

细胞计数关键注意事项和常见问题解决方案

在比较细胞计数方法和/或重复实验时，通常会直接选择“正确”结果，而忽略偏差或方法中固有的误差。在许多情况下，单次血细胞计数结果被默认为金标准，却未考虑统计因素。而流式细胞术作为细胞计数复杂性的另一极端，虽然极为准确，但许多人未意识到需要染料滴定（或抗体浓度优化）以获得最佳结果。

图5展示了因试剂滴定（或浓度优化）导致的结果变化。这一重要示例说明，使用 Countess 3 仪器获得准确的明场计数结果可能对下游荧光流式细胞术产生显著影响。

类似现象也出现在高细胞碎片或低细胞碎片的样本中。基于图像的计数技术的优势在于其提供的直接样本反馈。无论是新手还是专家用户，都可以通过直接观察佐证结果。如表1所示，使用 Countess 3 FL 仪器观察到了样本间和样本内的高度可重复计数结果。每个样本均取自同一 Jurkat 细胞母液，分装至计数室后，在 Countess 3 FL 仪器上使用默认配置读取四次。数据显示，重复计数间具有显著一致性。通过遵循样本制备的建议，实现了分装样本间的整体一致性。若样本制备不一致，样本1和样本2之间会出现显著差异。若仪器对焦、照明或阈值设定在样本或重复计数间不一致，变异系数（CV %）会显著升高。

流式细胞术展示的染料与细胞浓度不匹配的示例

图5. 流式细胞术展示的染料与细胞浓度不匹配的示例。 不同浓度的活 Jurkat 细胞用恒定浓度（10 µM）的 Invitrogen™ Vybrant™ DyeCycle™ Orange 染色。使用相同浓度的染料在低和高细胞浓度下均产生了较差的细胞周期直方图。而在最佳细胞浓度（1 × 10^6 细胞/mL）下染色，同一染料浓度下获得了最佳细胞周期直方图。

表1. Countess 3 FL 仪器观察到的重复细胞计数数据一致性。

 计数总数活细胞死细胞
样本11409198211
2409198211
3410197213
4403199204
CV (%)0.790.411.88
 计数总数活细胞死细胞
样本21395198197
2392198194
3391193198
4396197199
CV (%)0.780.852.12

总结

无论下游应用如何，获得准确且精密的细胞计数至关重要。错误的细胞计数可能导致简单的细胞分盘培养条件不理想，或因流式细胞术或成像应用中试剂滴定标记错误而导致实验失败。

Countess自动细胞计数仪凭借硬件和软件技术的重大进步及基于 AI 的图像分析，使科学家能够比以往更快速、更轻松地完成细胞计数。然而，稳定的操作和扎实的样本制备实践仍是成功与失败的关键区别，同样需要关注。

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