使用细胞计数仪与血球计数板的细胞计数的操作要点

在细胞生物学研究中，细胞计数是一项基础但至关重要的实验步骤，直接影响实验的可重复性和准确性。传统的血球计数板（Hemocytometer）长期以来是实验室的标准工具，但随着技术的发展，自动细胞计数仪逐渐成为更高效、更准确的选择。本文将对两种方法进行详细对比，以便实验者有更清晰的了解。

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血球计数板的计数方法与操作

1. 血球计数板的结构

血球计数板（Hemocytometer）是一种特制载玻片，通过精密蚀刻的网格系统实现细胞的手动计数和浓度计算。计数区由 9个1mm×1mm大方格 组成，四角的大方格分成16个中型方格，中央大方格分成400个小格（一般是16个中格 x 25个小格）。计数室深度固定为 0.1mm，因此每个大方格的体积为 0.1μL或者0.1mm³（1mm×1mm×0.1mm）。

2. 细胞分布假设

通过统计特定区域内的细胞数量，推算整体浓度（细胞数/mL）。基于泊松分布原理，要求细胞均匀分布且无聚集。如遇成团细胞，或者有细胞碎片，可能会影响到计数结果。

3. 操作步骤
   • 样本制备：将细胞悬液稀释至合适浓度（通常 10⁴–10⁶ cells/mL）。
   • 加样：取 10 µL 细胞悬液（如需染色，混合10μL细胞悬液 + 10μL台盼蓝）柔吹打或倒置混匀。用移液器将 10μL 混合液滴加至计数板盖玻片边缘，依靠毛细作用填充计数室。液体应自然铺满计数区，无气泡（否则需重做）。
   • 显微镜观察：一般在 10× 或 20× 物镜下观察，计数中央大方格内四角4个中方格的细胞数量。为了防止相邻的方格间重复统计，压在方格线上的细胞遵循记上不记下，记左不记右的原则。
   • 计算浓度：

   以中央大格（16个中格x25个小格）为例，四角的4个中格中一共有4x25 个（100个）小格。
   每小格细胞均数=100格细胞总数 ÷ 100
   细胞浓度（cell/mL）=小方格中细胞平均数x400 x 10 x 1000 x 稀释倍数
   其中：
   中央大方格的细胞数=小方格细胞平均数x400 （0.1mm³）
   x 10 转换为 1mm³ 中的细胞数
   x 1000 转换为 1cm³（1mL）中的细胞数

血球计数板的计算公式本质

将局部计数换算到 1 mL 体积，核心在于：

1. 数清细胞数 × 稀释倍数。
2. 除以实际计数的体积（通过选定方格区域和方格数）。

血球计数板的局限性

1. 主观性强：依赖操作者的经验，不同实验者可能得出不同结果。比如如果细胞较大，有的实验者可能依然使用中央大方格，有的实验者可能或选择四角的4个大方格；压线细胞的计数和成团细胞的计数也可能因人而异。
2. 耗时：每个样本需 3–5 分钟，重复计数更费时。
3. 误差大：
   • 细胞分布不均导致计数偏差。
   • 成团细胞难以准确分辨。
   • 活/死细胞判断依赖台盼蓝染色，显微镜下颜色差异不大，不容易区分，易受主观影响。
   随着成像技术的进步，细胞计数已实现自动化，从而在更短的时间和更少的努力下提供更高的准确性和可靠性。

Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪与血球计数板的细胞计数对比

细胞计数准确性

主观性导致的变异性

无论采用何种细胞计数方法，依赖操作员的判断都会导致结果误差。显微镜和某些自动细胞计数仪的光强度和焦距设置具有主观性，可能导致结果不一致。操作员还需决定哪些对象应纳入或排除在细胞计数中。如果测量细胞活性，操作员还需判断哪些细胞应计为死细胞或活细胞。手动计数中的这些主观变量可能导致不同操作员之间的结果差异较大。

Countess 3 和 Countess 3 FL 细胞计数器可以消除许多主观变量并节省时间。这些仪器采用先进算法自动确定最佳焦距和光强度，并通过定量测量（如细胞大小、亮度和圆度）来筛选细胞，而非依赖操作员的判断，从而减少主观性误差并提高样本和用户间的重复性（图1）。

计数的细胞数量

在实际操作中，许多研究人员未计数足够数量的细胞，导致细胞计数结果不可靠且标准差较高。为了节省手动计数时间，许多用户仅计数传统血细胞计数仪网格中的一两个方格。增加计数方格（即更大的面积）通常会提高结果的一致性，但需要更多时间。Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪在10秒的计数时间内可覆盖近四个传统血细胞计数仪方格的等效面积，从而通过减少细胞分布变异的影响提高计数一致性（图2）。

重复计数

无论采用何种细胞计数方法，多次重复计数均可减少样本的变异性。Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器可在血细胞计数仪完成一次计数（最多5分钟）的时间内完成多次重复计数，从而提高结果的准确性和可信度。由于时间限制，尤其是在需要计数多个细胞样本时，重复计数常被手动计数方法忽略。

成团细胞

对于含有成团细胞的样本，手动计数和某些自动细胞计数仪难以获得准确结果。成团细胞的常见挑战在于如何区分细胞边界以确定团块中的细胞数量。某些自动细胞计数仪仅能准确计数不超过五个细胞的团块。Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器的先进计数算法可清晰识别复杂细胞团块中的边界，从而提供准确的细胞计数（图3）。

除了识别团块中的单细胞外，Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪还能检测细胞聚集并测量样本中的总聚集百分比。屏幕显示通过不同颜色区分团块和单细胞，明场模式则可直观确认团块中的细胞。

荧光细胞计数

荧光细胞计数相比非荧光方法具有多项优势：背景对比度更高，便于识别和计数细胞；可使用不同荧光标记区分和计数多种细胞类型；减少将碎片误判为细胞的可能性，从而提高结果准确性。

Countess 3 FL 自动细胞计数仪配备两个可选的可互换荧光通道，通过插入不同光立方收集颜色（提供超过20种光立方）。仪器自动确定最佳照明条件，并支持两种计数模式：明场和荧光。明场模式利用明场图像识别细胞并快速报告荧光阳性细胞百分比；荧光模式则通过一个或两个荧光通道计数所有荧光对象，并报告总计数及各通道的荧光细胞分布（图4）。

图4. 使用 Countess 3 FL 自动细胞计数仪和两个光立方进行荧光细胞计数。细胞经 Invitrogen™ ReadyCount™ 绿/红细胞活性染色（货号 A49905）后，采用两种方法计数：（A）明场模式下的 U2OS 细胞，显示所有识别细胞；（B）荧光模式下的 PBMC，仅显示荧光阳性细胞。

节约成本

采用自动细胞计数仪的阻碍之一是专用一次性载玻片的持续成本。血细胞计数仪可无限次清洗和重复使用，而许多自动系统需依赖一次性载玻片。Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪设计兼容可重复使用的玻璃载玻片（图5），同时也支持一次性载玻片。这一创新使实验室能够在无需承担高昂耗材成本的情况下采用先进的细胞计数方法。

节省时间

手动计数（最多5分钟）与 Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪（几十秒）的时间差常被忽视。若每天计数五张载玻片（每张两个样本），改用自动计数器搭配可重复使用载玻片每月可节省约10小时；使用一次性载玻片则可节省约15小时（图6）。这些时间可用于实验室的其他工作，从而显著提升效率。

可获取的信息

血细胞计数仪仅能提供样本中的总细胞数、活细胞数和死细胞数。自动细胞计数仪还可获取更多数据，如平均细胞大小、基于荧光强度或细胞大小的分布直方图（图7）。Countess 3 和 Countess 3 FL 仪器可将数据以 CSV 格式保存至 USB 驱动器，原始图像和结果界面也可保存并传输至电脑。

Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪与血球计数板的细胞计数对比总结

自动细胞计数相比手动计数具有显著优势，包括更高的准确性、简化的工作流程和大幅节省的时间。尽管存在这些优势，一次性载玻片的成本曾是采用自动细胞计数技术的障碍。Countess 3 和 Countess 3 FL 自动细胞计数仪兼容可重复使用载玻片，降低了自动细胞计数的成本，使更多实验室能够负担这一先进技术，从而获得更快、更准确的计数结果。

Countess 3 能带来：

✅ 更快——十几秒出结果，提升实验效率。
✅ 更准——减少人为误差，数据可重复性高。
✅ 更智能——自动分析成团细胞、荧光标记。
✅ 更经济——节省耗材与人工时间成本。

对于需要较高通量、高准确性的现代实验室，Countess 3 自动细胞计数仪是比传统血球计数板更优的选择。它不仅解决了手动计数的固有缺陷（如主观性和低效性），还通过自动化、荧光分析和可重复使用耗材进一步降低了实验成本。

推荐场景：

• 常规进行哺乳类细胞培养（培养，传代，冻存等）。
• 需要快速处理大量样本（如细胞培养 QC）。
• 要求高重复性的实验（如药物筛选、CRISPR 编辑）。
• 需荧光标记的细胞分析（如PBMC细胞死活分析）。

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仅供研究使用。不用于诊断程序。