荧光显微镜基础知识

落射荧光显微镜

您真的不需要详细了解显微镜如何工作以进行荧光成像，但当需要排除故障时，它会提供一点帮助，由于考虑到迭代科学的原理，最终大约 99.8% 的时间是这样的，不是吗？如果您尝试解决成像问题，您可能需要了解的其中一个因素是荧光基团的滤光片设置。

大多数荧光成像使用包含以下基本组分的荧光显微镜进行：

• 光源： 通常是氙弧或汞蒸气灯，但最近更多的是高功率 LED
• 滤光片（入射光）： 它将入射光的波长缩小到仅用于激发样品的波长，有趣的是，其被称为激发滤光片
• 二向色分色镜或反射镜：  将激发光反射至样品，并同时将来自样品的发射光仅传递到检测仪（如下图）
  
• 滤光片（发射光）： 仅传递来自样品的发射光的波长，并阻断所有通过激发滤光片的光线，如您所想，其被称为发射滤光片
• CCD 相机： 如果您无法检测到发射光，它则没有任何用处，而对于荧光成像来说，检测仪通常是 CCD 相机。这种相机通常也连接到计算机屏幕，能够为您呈现图像。

图 1.二向色分色镜允许较长波长的光线通过滤光片，同时反射较短波长的光线。

落射荧光显微镜中的光路

下图显示了落射荧光显微镜的典型光路。大多数用于细胞生物学的显微镜都经过设计，让光线穿过物镜照射样品，然后来自样品的发射光穿过同一个物镜到达检测仪。

图 2.黄线表示明场照明的光路设置。照明光不会穿过物镜，只有来自样品的投射光穿过物镜。蓝线表示激发光的路径，该光穿过滤光片和物镜到达样品，产生发射光（显示为绿色）同时穿过物镜和滤光片并到达检测仪。在落射荧光显微镜中，激发光和发射光都穿过同一个物镜。

这种设置—照明光和发射光都穿过同一物镜—被称为落射荧光显微镜 (epifluorescence microscopy)，词中“epi”借用自希腊语，意为“相同”。更正确的术语应该是落射荧光照明，但由于荧光依赖于照明，大多数人默认省略了照明部分。透射荧光显微镜并不常见，但您仍然可能会遇到以下情况：在载物台的相对（反）侧，样品位于两者之间。

图 3. 落射荧光显微镜中的典型光路。注意，激发光和发射光均由分光镜控制，其将激发光（较短波长）反射到样品上，并将产生的发射光（较长波长）通过滤光片传递到检测仪(观察者或相机）上。

放大倍数与分辨率

放大倍数

当您进行荧光成像时，为了获得良好的结果，理解 放大倍数 和 分辨率 的区别很重要。当谈论放大倍数时，指的是当我们在显微镜下观察物体时，显示它比原本放大了多少（图 4）。

分辨率

相反，在实际意义上谈论分辨率时，指的是我们在图片中能够分辨多少细节，这可能是主观的。在技术层面更深入地讲，分辨率受到光折射特性的限制。

落射荧光显微镜的极限分辨率

这到底是什么意思？它典型的 落射荧光照明 复合物显微镜无法分辨或区分距离小于 200 nm 的两个物体。此外，由于整个样品被同时照射，所以您可以检测到样品中所有聚焦和离焦的光线。这些限制意味着，根据物镜中的镜片，您能够确定同一细胞中存在两种不同颜色的探针，但如果没有很多对照、单像素分析和计算，您可能始终无法分辨它们之间的空间关系。此外，由于您没有任何深度相关信息，因此无法从 落射荧光显微镜拍摄的图片中真正得出关于体积的任何可靠结论。通过了解系统的限制，您可以对收集的数据和图像充满信心，也能够理解您的数据并得出结论。

激光扫描共聚焦显微镜 仍然依赖于复合光显微镜设置，但可以为您提供更高的分辨率。分辨率提高是由于使用激光进行照明，从而将激发光范围缩小到 ~2–3 nm。这比使用激发滤光片组时得到的波长范围准确 10 倍。此外，仅从一个焦平面获得图像，同时去除实验中生成的所有分散和离焦光线，从而也可以提高分辨率。使用针孔阻挡离焦光线到达检测仪，从而完成了对单个聚焦平面的限制，这称为 选择性分区。这种针孔只允许来自样品很窄区间的光，并为您提供有关深度方面的信息。这比使用落射荧光获得的分辨率有所改善，落射荧光从一个细胞内多焦平面收集光线。对于想要获得更高分辨率的科学家而言，还可以通过其他选择获得更高的分辨率，但这些选择往往更具专业性，且需要更多的技术知识才能展开工作。

图 6. 不同显微镜的分辨能力，以及光学显微镜和电子显微镜视野内的代表性物体。

正置与倒置显微镜

有时，您会听到人们将显微镜称为 正置 或者 倒置。这些术语指的是一些元件的位置，例如物镜和光源。正置显微镜的物镜置于放置样品的载物台上方；倒置显微镜的物镜置于放置样品的载物台下方。

正置和倒置显微镜在通过各种路径产生和引导光线的能力方面没有根本区别。您所获得的图像质量与样品制备、镜片、光源和波长、 荧光基团滤光片组和相机等更相关，而非显微镜元件的位置。一些实验需要特定的方向才能获得您所需的结果，因此观察一台新显微镜并全面考虑实验步骤以确定其设置符合您的实验需要，这始终是一种明智的做法。

图 7.倒置和正置显微镜均使用落射荧光照明：主要区别是物镜相对于放置样品的载物台的位置。

荧光显微镜

您并不需要详细了解显微镜的工作原理才能进行荧光成像，但是这能够对故障排除有所帮助——考虑到科学研究的重复性，这大概会占到99.8%的时间。并且如果您试图解决成像问题，确实需要了解荧光基团的滤光片设置。

大部分荧光成像通过荧光显微镜完成，其包括以下基本元件：

• 光源: 通常是氙弧灯或汞灯，但近年来也使用高功率LED
• 滤光片（入射光）: 将入射光波长缩减到只留下用于激发样品的波长，有趣的是，其被称为激发滤光片
• 二向分色镜或反射镜:  将激发光反射到样品上，并同时只通过来自样品的发射光，传递到检测仪（如下图）
  
• 滤光片（发射光）: 只能通过来自样品的发射光波长，并阻挡所有通过激发滤光片的光线，如您所想，其被称为发射滤光片
• CCD照相机: 发射光如果不能检测到，则没有任何用处；对于荧光成像来说，检测仪通常是CCD照相机，这种照相机一般也连接到电脑屏幕，能够为您呈现图像。

图 1. 二向分色镜允许较长波长的光线通过滤光片，同时反射较短波长的光线。

荧光显微镜中的光路

下图展示了荧光显微镜的典型光路。大部分用于细胞生物学的显微镜都设计为让光线穿过物镜照射样品，然后来自样品的发射光再通过同一个物镜到达检测仪。

图 2. 倒置和正置显微镜都使用荧光照明：主要的区别是物镜相对于放置样品的载物台的位置。
 

照射和发射光通过同个物镜的设计被称为落射荧光显微镜（epifluorescence microscopy），词中的“epi”借用自希腊语，意为“相同”，更加准确的说法应是落射荧光照明，但是因为荧光依赖于照明，所以人们默认省略了照明部分。透射照明荧光显微镜不常见，但是您也可能遇到放置样品的载物台在中间，照射和信号收集在其两侧的设置方法。

图 3. 落射荧光显微镜的典型光路。注意激发光和发射光通过分光镜控制，其将激发光（较短波长）反射到样品上，而让得到的发射光（较长波长）通过滤光片到达检测仪（观察者或照相机）。

放大倍数与分辨率

放大倍数

为了在荧光成像中获得良好结果，理解放大倍数和分辨率的区别很重要。当提到放大倍数，指的是当我们在显微镜下观察一个对象时，它比原本放大了多少（图4）。

分辨率

与此相反，实际意义上的分辨率指的是图片中我们能够分辨多少细节，这可能是主观的。从技术层面更深入地讲，分辨率受到光的折射特性的限制。

荧光显微镜的极限分辨率

这到底是什么意思？它指典型的落射荧光照明复合显微镜无法分辨或区分距离小于200 nm的两个物体。此外，因为整个样品被同时照射，所以样品中所有聚焦和离焦的光线都被检测到。这些限制意味着，根据物镜中的镜片，您可能能够确定一个细胞中的两个不同颜色的探针，但是如果没有很多对照、单像素分析和计算，就无法分辨它们之间的空间关系。此外，因为您没有掌握任何深度相关信息，所以无法从落射荧光显微镜拍摄的图片中得到关于体积的可靠结论。通过了解系统的限制，您能够对获得的数据和图像更加确信，也能够完全理解您的数据并明确表达结论。

激光扫描共聚焦显微镜也依赖于复合光显微镜设置，但能够获得更高的分辨率。其分辨率的提高源于使用激光作为照明，其将激发光范围缩窄到~2-3nm。这比使用激发滤光片组准确十倍。此外，一次实验中只从一个焦平面获得图像，使用针孔阻挡离焦光线到达检测仪，可以去除所有分散和离焦光线，从而提高了分辨率对单个焦平面的限制，这被称为选择性分区。这种针孔只允许来自样品很窄区间的光线通过，所以能够改善深度方面的信息。这比使用落射荧光获得的分辨率有所提高，落射荧光收集一个细胞中很多焦平面的光线。科研人员也可以通过其他选择获得更高的分辨率，但是这些方法更加专业化，并需要更多的技术知识才能着手。

图 6. 不同显微镜的分辨能力，以及光学显微镜和电子显微镜视野内的代表性物体。

正置和倒置显微镜

有时候听到人们称显微镜为正置或者倒置，这些术语指的是一些元件的位置，如物镜和光源。正置显微镜的物镜在放置样品的载物台之上；倒置显微镜的物镜在放置样品的载物台之下。

正置和倒置显微镜产生和引导光线通过不同路径的能力并没有根本不同。其实您所能获得的图像质量与样品制备、镜片、光源和波长、染料滤光片组设置以及照相机等更加相关，而非显微镜元件的位置。一些实验需要特定方向才能获得所需的结果，所以观察一台没用过的显微镜并全面考虑实验步骤以确定其设置符合您的实验需要，这始终是一种明智的做法。

图 7. 黄线表示明场照明的光路设置，照射光不穿过物镜，只有来自样品的投射光穿过物镜。蓝线表示激发光线路径，它穿过滤光片和物镜到达样品，得到的发射光（显示为绿色）同时穿过物镜和滤光片并到达检测器。在落射荧光显微镜中，激发光和发射光都穿过同一个物镜。