Search
蛋白质印迹法总蛋白归一化试剂
总蛋白归一化
总蛋白归一化是获得精确、定量蛋白质印迹法数据的有效方法。Invitrogen 免染型蛋白标记试剂是一种快速、易用、共价蛋白标记试剂，用于蛋白质转移后的凝胶或膜，可对蛋白质进行灵敏的线性检测，从而实现蛋白质印迹数据的总蛋白归一化。Invitrogen 免染型蛋白标记试剂还可作为快速、灵敏的蛋白染色试剂，用于凝胶中蛋白的可视化。
免染型蛋白标记试剂
- 用途广泛—用于在凝胶和膜上快速标记总蛋白。与所有凝胶化学体系兼容，可用于下游凝胶染色、蛋白转印、免疫印迹和质谱分析。兼容。
- 更快的操作流程—混合、孵育后即可成像。凝胶和膜的反应时间均只需 10 分钟。
- 灵活的可视化兼容各种常用的激发光源，包括紫外光和绿色荧光。最佳成像条件：最大激发波长：~488 nm., 最大激发波长：590 nm.
- 精确的总蛋白归一化—使用 iBright FL1500 成像系统进行成像和总蛋白归一化分析仅需几分钟
- 宽线性动态范围—每孔的总蛋白上样量范围为 1–80 µg。
- 灵敏且稳定的信号—可检测低至 20 ng 的蛋白条带，且信号与下游抗体检测兼容。
- 灵敏度可调—延长孵育时间或加倍试剂浓度可产生更强信号，从而提高对低丰度蛋白的检测能力。
操作视频
如何使用 Invitrogen No-Stain 免染型蛋白标记试剂和 iBright 成像系统快速、简单、准确地进行总蛋白归一化
本视频详细介绍了如何使用免染型蛋白质标记试剂标记蛋白质。视频的后半部分介绍了使用 iBright 成像系统对蛋白质印迹数据进行总蛋白归一化所需的仪器操作步骤。
演示视频
如何使用Invitrogen No-Stain蛋白标记试剂和iBright智能成像系统进行快速、简单和准确的定量Western Blot
这个演示视频为您展现如何使用No-Stain蛋白标记试剂快速、简单地标记印迹上的蛋白质。视频的后半部分逐步演示了如何在iBright智能成像系统上对western blot数据进行总蛋白归一化。
| 反应次数 | 标准试剂盒可标记 40 个小型膜或 40 块小型凝胶，或两者的组合。 |
| 反应时间 | 10 分钟 |
| 凝胶兼容性 | 与任何凝胶类型（预制或自制）或凝胶体系（(Bis-Tris, Tris-甘氨酸, Tris-乙酸, Tricine）兼容 |
| 膜兼容性 | PVDF、硝酸纤维素膜 |
| 免疫检测试剂兼容性 | 与所有下游免疫检测步骤兼容，包括化学发光或荧光检测体系 |
| 最大激发和发射波长 | 激发波长：~488 nm（蓝光） 发射波长：590 nm |
| 检测灵敏度 | 20 ng/条带 |
| 线性范围 | 每条泳道总蛋白的上样量为 1–80 μg |
| 成像仪要求 | 兼容各种带有紫外或荧光光源的成像仪，例如 iBright FL1500 成像系统 |
| 工作原理是什么？ | 免染型蛋白标记试剂与蛋白样品中的部分赖氨酸侧链形成共价键 |
| 试剂盒成分和储存条件 | 免染型活化剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型衍生剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型标记缓冲液，20X（每瓶 2 x 20 mL；储存温度为15—30⁰C） |
| 保质期 | 至少 2 年 |
用于在凝胶或膜上标记蛋白质的No-Stain免染型试剂使用方法
图 1：No-Stain 免染型蛋白标记试剂的使用方法
免染型蛋白标记试剂工作液的制备
按照下表所示，混合所需试剂，制备所需体积的免染型蛋白标记试剂。
| No-Stain 蛋白标记试剂，1X | No-Stain 标记缓冲液，20X | 超纯水 | No-Stain 活化剂 | No-Stain 衍生剂 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 小型凝胶 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 20 µL | 20 µL |
| 小型膜 | 10 mL | 0.5 mL | 9.5 mL | 20 µL | 20 µL |
| 中型膜 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 40 µL | 40 µL |
在蛋白质印迹实验中，不一致的蛋白样品浓度、不同的凝胶上样量以及印迹过程中的转印误差都会导致结果的变化。蛋白归一化可以校正这种偏差，是获得可靠且可重复的定量蛋白质印迹数据的关键步骤。蛋白归一化方法包括使用内源性管家蛋白（如 GAPDH、β-微管蛋白、β-肌动蛋白或亲环蛋白 B）、外源性对照物或总蛋白作为对照进行标准化。
近年来，期刊编辑和审稿人要求采用能够提高定量蛋白质印迹数据准确性和可重复性的方法。许多知名期刊已经制定了蛋白质印迹法研究投稿指南，以下摘录了部分指南内容。
- “进行定量比较时，应使用适当的试剂、对照和线性信号范围的成像方法” – 《自然》
- “记录数据的获取方式、信号强度是否与抗原加样量呈线性关系以及蛋白加样如何标准化” – 《生物化学杂志》
- “尽可能将信号强度基于总蛋白进行归一化（通过染色膜评估总蛋白上样量）” – 《生物化学杂志》
- “在没有证据表明操作不影响表达水平的情况下，不应使用管家蛋白进行归一化” – 《生物化学杂志》
管家蛋白 的使用有其缺点，因为管家基因蛋白的表达会因实验条件而异，而且它们通常会产生过饱和的蛋白质印迹法信号。
使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化，可避免使用管家蛋白 带来的变数和不准确性，并节省使用免疫印迹检测管家基因蛋白所需的时间、精力和成本，因为免疫印迹可能需要剥离印迹并重新检测。
在所有实验条件下，精确的对照物应显示信号强度与样品上样量之间的线性关系。在不同实验条件下，用 No-Stain 试剂标记膜上的总蛋白得到的信号强度，信号强度与样品上样量之间都呈线性关系（图 2）。因此，No-Stain 试剂可用于定量蛋白质印迹分析，将总蛋白作为理想的上样对照。
No-Stain 试剂与管家蛋白的线性度比较
下图 2 中的图表显示了使用No-Stain 蛋白标记试剂进行总蛋白归一化时，线性信号响应与每孔蛋白上样量之间的关系。在更高的裂解液上样量下，管家蛋白的信号趋于饱和，导致归一化结果不够精确。
图 2.使用 No-Stain 蛋白标记试剂进行总蛋白的归一化：将 10 至 50 µg 的 HeLa 裂解液加样到 4-12% 的 Bis-Tris Plus 凝胶中，并使用 MES 缓冲液进行电泳。使用 Invitrogen iBlot 2 快速干转装置和 iBlot 2 膜组、PVDF、mini（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转移到 PVDF 膜上。在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜两次，每次 2 分钟，然后用 10 ml No-Stain 标记试剂在旋转平台上孵育 10 分钟。接下来，在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜 3 次，每次 2 分钟，接着进行 β-肌动蛋白（货号：AM4302）、GAPDH（货号：398600）和 α-微管蛋白（货号：138000），然后用山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号：A21058）进行免疫印迹。使用 iBright 成像仪对印迹进行成像。通过 iBright 软件来定量泳道中的总蛋白信号。使用 No-Stain 蛋白标记试剂在整个上样范围内绘制数据的线性回归值被确定（R2= 0.9990），而 β-肌动蛋白、GAPDH 和 α-微管的R2值分别为 0.8851、0.9438和0.8332。
下图 3 展示了使用 No-Stain 蛋白标记试剂和硝酸纤维素膜对目标蛋白进行归一化。
图 3.使用 No-Stain 蛋白标记试剂和iBright成像系统进行定量蛋白质印迹分析。使用 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright 成像系统进行定量 WB 分析。使用 Novex 4-12% Tris-Glycine 凝胶（楔形孔）加样，并使用表达 RB1 的 HeLa 细胞裂解液进行电泳，总蛋白上样量为 0.6 至 10 µg。使用 iBlot 2 干式转印系统将凝胶中的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上使用 No-Stain 蛋白标记试剂对硝酸纤维素膜标记 10 分钟，然后用iBright成像仪对标记的膜进行成像。用同样经过 No-Stain 标记的膜，用一种用 Alexa Fluor 645 染料标记的特异性抗体检测 RB1。用 iBright 归一化软件对加入 HeLa 裂解液（0.6 至 10 µg）的泳道中的总蛋白信号以及 RB1免疫检测条带的信号强度进行定量。绘制总蛋白加样和 RB1 的信号强度曲线。
用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质
No-Stain 蛋白标记试剂在 10 分钟内与凝胶中的所有蛋白的赖氨酸侧链部分形成共价键。
- 它是传统凝胶染色试剂的理想替代品—无需脱色，可在各种蛋白裂解液上样量（1-80µg）下实现精确归一化
- 灵敏——检测下限为20ng/条带
- 特异——仅与蛋白质的赖氨酸侧链结合。游离标签不会自发荧光，因此可获得卓越的信噪比
- 灵活——与任何凝胶类型兼容；无需更换凝胶即可体验免染型的便利性
下图4显示使用 No-Stain 蛋白标记试剂对印迹上的蛋白质进行标记，转印后呈线性且与蛋白上样量成比例。
图 4.膜上蛋白质的 No-Stain 标记信号响应呈线性。在 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型凝胶的 1 号泳道中，上样 HeLa 裂解液（ 1 至 5050 µg）和 PageRuler 非预染蛋白分子量标准 。使用 MES 电泳缓冲液进行电泳后，使用 Invitrogen Power Blotter 和 Power Blotter 膜组将蛋白质转移到 PVDF 膜上（10 分钟）。在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜两次，每次 2 分钟。向放有 PVDF 膜的器皿中加入 10 ml No-Stain 标记溶液，开始标记反应。在旋转平台上进行 10 分钟标记反应。然后在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜 3 次，每次 2 分钟。使用 iBright 成像仪设置 No-Stain 膜曝光参数（455—485 nm 激发，565—615 nm 发射），然后拍摄图像。
定量凝胶染色
图 5 显示了使用 No-Stain 蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质时，信号与蛋白含量的线性关系。
图 5.定量凝胶染色。将浓度为 2.5 至 80 µg 的HeLa 裂解液装入 4-12% 的 Bis-Tris Plus 小型凝胶，并用 MES 电泳缓冲液进行电泳。电泳后，按照凝胶中蛋白质标记的 No-Stain 蛋白质标记试剂盒的说明对凝胶中的蛋白质进行标记，并使用 iBright 成像仪对凝胶成像，该成像仪配有透射激发器（490-520 nm）和565-615 nm 发射滤光片。
No-Stain 标记蛋白的信号强度随孵育时间增加
No-Stain 蛋白标记试剂的灵敏度可以微调，以优化低丰度蛋白的检测。延长 No-Stain 试剂孵育凝胶或印迹的时间，信号强度可呈线性增加。或者，当时间有限时，将 No-Stain 蛋白标记试剂的浓度加倍，可在较短的标记时间内获得类似的结果。曝光时间可以轻松设置和调整，以适应实验条件，使用iBright成像系统，将方法检测能力扩展到更广泛的蛋白质表达水平。
点击图片放大
图 6：延长孵育时间可提高 No-Stain 标记试剂的灵敏度。转印后的 PVDF 膜分别与 No-Stain 标记试剂孵育 10、20、30 和 40 分钟，随着时间的延长，信号强度增加。在 Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶中上样 40至1.25 μg 的大肠杆菌裂解物，并使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。使用 Invitrogen iBlot 2 快速干转系统和 iBlot 2 转印膜组（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转印到小型 PVDF 膜上。用20 ml 超纯水快速冲洗 PVDF 膜，然后在旋转平台上用 10 mL No-Stain 蛋白标记试剂工作液进行孵育。在加入 No-Stain 蛋白标记试剂后 10、20、30 和 40 分钟，使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统采集印迹并分析图像（曝光时间 1000 秒），未对图像进行亮度和对比度调整。曝光时间越长，信号越强，从而提高对低表达蛋白的检测能力（A）。可以观察到归一化信号强度与孵育时间呈线性相关（B）。
将 No-Stain 蛋白标记试剂的浓度加倍，信号强度会增强
点击图片放大
图7.将 No-Stain 标记试剂的浓度加倍可提高检测灵敏度。在 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶中上样加入了 Bolt LDS 样品缓冲液的 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 梯度稀释），然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质直接在凝胶上用 1x 或 2x No-Stain 工作液进行标记。1X No-Stain 工作液根据 No-Stain 蛋白质标记试剂的标准方案制备。1X No-Stain 工作液通过将 No-Stain 活化剂（40μL）和 No-Stain 衍生剂（40μL）的浓度加倍制备。使用Invitrogen iBright FL1500成像系统（曝光时间1000秒）采集凝胶（A）和膜（B）的分析图像，未进行亮度和对比度调整。
No-Stain 标记凝胶的免疫印迹
No-Stain 蛋白标记试剂的功能性适用于蛋白转印和免疫印迹。使用 No-Stain 试剂对蛋白质进行标记不会影响蛋白转印效率，并且与下游蛋白质印迹法兼容，如图 8 所示。
点击图片放大
图8. No-Stain 标记试剂与蛋白转印和免疫印迹兼容。在 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶中上样加入了 Bolt LDS 样品缓冲液的 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 梯度稀释），然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。将凝胶在旋转平台上与 No-Stain 蛋白标记试剂一起孵育 10 分钟。使用 Invitrogen iBlot 2 快速干转系统和 iBlot 2 转印膜组（P0 方案，7 分钟）将No-Stain标记凝胶中的蛋白转印到小型 PVDF 膜上。然后使用特异性一抗对 PVDF 膜进行检测，并使用标记有 Alexa 荧光 800 染料的二抗检测蛋白质。使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的图像。
灵敏度与考马斯染色相当，但所需时间更短
No-Stain 蛋白标记试剂提供了一种快速、灵敏的方法，用于在凝胶和膜上可视化蛋白，无需冗长的脱色步骤和使用甲醇。
点击图片放大
图9.No-Stain 标记试剂的灵敏度与考马斯染色相当。在 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶中上样加入了 Bolt LDS 样品缓冲液的 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 梯度稀释），然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质条带用 No-Stain 蛋白标记试剂或考马斯亮蓝染料标记。使用Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的图像。此外，No-Stain 结果图像的曝光时间可以增加，以便与考马斯蓝相比，更好地检测丰度更低的蛋白裂解物。
No-Stain蛋白标记试剂与化学发光和荧光检测体系兼容。因此，您可以继续使用实验室已有的酶标二抗。在使用荧光抗体偶联物设计实验时，重要的是选择与免染型标签的激发和发射光谱不重叠的荧光团，当 No-Stain 标签与赖氨酸残基共价结合时，在约 488 nm 光源激发下，在约 590 nm 处发光。荧光基团选择取决于荧光成像仪的滤光片组。
您可以将二抗荧光偶联物的激发和发射光谱与No-Stain标签的激发和发射光谱进行比较，以评估与当前抗体偶联物的兼容性。图 6 显示了共价结合的 No-Stain 标签的激发和发射光谱。
表 1.与 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright FL1500 成像系统兼容的荧光二抗。
| Alexa Fluor 偶联物 | 激发/发射 (nm) | Alexa Fluor 二抗 |
|---|---|---|
| Alexa Fluor 635 | 621/639 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 647 Alexa Fluor Plus 647 | 650/665 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 660 | 660/689 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 680 Alexa Fluor Plus 680 | 679/702 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 700 | 702/724 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 750 | 749/775 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 790 | 784/814 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor Plus 800 | 777/794 | 查看抗体货号 |
点击放大图片
图 10.共价连接的 No-Stain 标签的激发和发射光谱。共价键连接的 No-Stain 标签的激发最大值约为 488 nm，发射最大值为 590 nm。光谱显示， No-Stain 标签的信号可以使用紫外或荧光光源成像，并且可以使用各种发射滤光片捕获信号。
表1列出了在使用 iBright FL1500 成像系统成像时与共价连接的 No-Stain 标签兼容的荧光基团的部分列表。任何偶联物都可以单独与 No-Stain 标签和 iBright 成像仪一起使用。如果使用两种荧光基团和 No-Stain 蛋白质标记试剂进行多重标记，则从 600 nm 范围内选择一种荧光团，从 700 nm 范围内选择另一种荧光团，以便每种荧光团都可以通过不同的 iBright 发射滤光片成像。
表 1.与 iBright FL1500 成像系统一起使用 No-Stain 蛋白标记试剂时兼容的荧光二抗。
| 反应次数 | 标准试剂盒可标记 40 个小型膜或 40 块小型凝胶，或两者的组合。 |
| 反应时间 | 10 分钟 |
| 凝胶兼容性 | 与任何凝胶类型（预制或自制）或凝胶体系（(Bis-Tris, Tris-甘氨酸, Tris-乙酸, Tricine）兼容 |
| 膜兼容性 | PVDF、硝酸纤维素膜 |
| 免疫检测试剂兼容性 | 与所有下游免疫检测步骤兼容，包括化学发光或荧光检测体系 |
| 最大激发和发射波长 | 激发波长：~488 nm（蓝光） 发射波长：590 nm |
| 检测灵敏度 | 20 ng/条带 |
| 线性范围 | 每条泳道总蛋白的上样量为 1–80 μg |
| 成像仪要求 | 兼容各种带有紫外或荧光光源的成像仪，例如 iBright FL1500 成像系统 |
| 工作原理是什么？ | 免染型蛋白标记试剂与蛋白样品中的部分赖氨酸侧链形成共价键 |
| 试剂盒成分和储存条件 | 免染型活化剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型衍生剂（800 µL；储存温度为 -20⁰C）； 免染型标记缓冲液，20X（每瓶 2 x 20 mL；储存温度为15—30⁰C） |
| 保质期 | 至少 2 年 |
用于在凝胶或膜上标记蛋白质的No-Stain免染型试剂使用方法
图 1：No-Stain 免染型蛋白标记试剂的使用方法
免染型蛋白标记试剂工作液的制备
按照下表所示，混合所需试剂，制备所需体积的免染型蛋白标记试剂。
| No-Stain 蛋白标记试剂，1X | No-Stain 标记缓冲液，20X | 超纯水 | No-Stain 活化剂 | No-Stain 衍生剂 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 小型凝胶 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 20 µL | 20 µL |
| 小型膜 | 10 mL | 0.5 mL | 9.5 mL | 20 µL | 20 µL |
| 中型膜 | 20 mL | 1 mL | 19 mL | 40 µL | 40 µL |
在蛋白质印迹实验中，不一致的蛋白样品浓度、不同的凝胶上样量以及印迹过程中的转印误差都会导致结果的变化。蛋白归一化可以校正这种偏差，是获得可靠且可重复的定量蛋白质印迹数据的关键步骤。蛋白归一化方法包括使用内源性管家蛋白（如 GAPDH、β-微管蛋白、β-肌动蛋白或亲环蛋白 B）、外源性对照物或总蛋白作为对照进行标准化。
近年来，期刊编辑和审稿人要求采用能够提高定量蛋白质印迹数据准确性和可重复性的方法。许多知名期刊已经制定了蛋白质印迹法研究投稿指南，以下摘录了部分指南内容。
- “进行定量比较时，应使用适当的试剂、对照和线性信号范围的成像方法” – 《自然》
- “记录数据的获取方式、信号强度是否与抗原加样量呈线性关系以及蛋白加样如何标准化” – 《生物化学杂志》
- “尽可能将信号强度基于总蛋白进行归一化（通过染色膜评估总蛋白上样量）” – 《生物化学杂志》
- “在没有证据表明操作不影响表达水平的情况下，不应使用管家蛋白进行归一化” – 《生物化学杂志》
管家蛋白 的使用有其缺点，因为管家基因蛋白的表达会因实验条件而异，而且它们通常会产生过饱和的蛋白质印迹法信号。
使用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂进行总蛋白归一化，可避免使用管家蛋白 带来的变数和不准确性，并节省使用免疫印迹检测管家基因蛋白所需的时间、精力和成本，因为免疫印迹可能需要剥离印迹并重新检测。
在所有实验条件下，精确的对照物应显示信号强度与样品上样量之间的线性关系。在不同实验条件下，用 No-Stain 试剂标记膜上的总蛋白得到的信号强度，信号强度与样品上样量之间都呈线性关系（图 2）。因此，No-Stain 试剂可用于定量蛋白质印迹分析，将总蛋白作为理想的上样对照。
No-Stain 试剂与管家蛋白的线性度比较
下图 2 中的图表显示了使用No-Stain 蛋白标记试剂进行总蛋白归一化时，线性信号响应与每孔蛋白上样量之间的关系。在更高的裂解液上样量下，管家蛋白的信号趋于饱和，导致归一化结果不够精确。
图 2.使用 No-Stain 蛋白标记试剂进行总蛋白的归一化：将 10 至 50 µg 的 HeLa 裂解液加样到 4-12% 的 Bis-Tris Plus 凝胶中，并使用 MES 缓冲液进行电泳。使用 Invitrogen iBlot 2 快速干转装置和 iBlot 2 膜组、PVDF、mini（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转移到 PVDF 膜上。在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜两次，每次 2 分钟，然后用 10 ml No-Stain 标记试剂在旋转平台上孵育 10 分钟。接下来，在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜 3 次，每次 2 分钟，接着进行 β-肌动蛋白（货号：AM4302）、GAPDH（货号：398600）和 α-微管蛋白（货号：138000），然后用山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号：A21058）进行免疫印迹。使用 iBright 成像仪对印迹进行成像。通过 iBright 软件来定量泳道中的总蛋白信号。使用 No-Stain 蛋白标记试剂在整个上样范围内绘制数据的线性回归值被确定（R2= 0.9990），而 β-肌动蛋白、GAPDH 和 α-微管的R2值分别为 0.8851、0.9438和0.8332。
下图 3 展示了使用 No-Stain 蛋白标记试剂和硝酸纤维素膜对目标蛋白进行归一化。
图 3.使用 No-Stain 蛋白标记试剂和iBright成像系统进行定量蛋白质印迹分析。使用 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright 成像系统进行定量 WB 分析。使用 Novex 4-12% Tris-Glycine 凝胶（楔形孔）加样，并使用表达 RB1 的 HeLa 细胞裂解液进行电泳，总蛋白上样量为 0.6 至 10 µg。使用 iBlot 2 干式转印系统将凝胶中的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上使用 No-Stain 蛋白标记试剂对硝酸纤维素膜标记 10 分钟，然后用iBright成像仪对标记的膜进行成像。用同样经过 No-Stain 标记的膜，用一种用 Alexa Fluor 645 染料标记的特异性抗体检测 RB1。用 iBright 归一化软件对加入 HeLa 裂解液（0.6 至 10 µg）的泳道中的总蛋白信号以及 RB1免疫检测条带的信号强度进行定量。绘制总蛋白加样和 RB1 的信号强度曲线。
用 No-Stain 免染型蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质
No-Stain 蛋白标记试剂在 10 分钟内与凝胶中的所有蛋白的赖氨酸侧链部分形成共价键。
- 它是传统凝胶染色试剂的理想替代品—无需脱色，可在各种蛋白裂解液上样量（1-80µg）下实现精确归一化
- 灵敏——检测下限为20ng/条带
- 特异——仅与蛋白质的赖氨酸侧链结合。游离标签不会自发荧光，因此可获得卓越的信噪比
- 灵活——与任何凝胶类型兼容；无需更换凝胶即可体验免染型的便利性
下图4显示使用 No-Stain 蛋白标记试剂对印迹上的蛋白质进行标记，转印后呈线性且与蛋白上样量成比例。
图 4.膜上蛋白质的 No-Stain 标记信号响应呈线性。在 Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 小型凝胶的 1 号泳道中，上样 HeLa 裂解液（ 1 至 5050 µg）和 PageRuler 非预染蛋白分子量标准 。使用 MES 电泳缓冲液进行电泳后，使用 Invitrogen Power Blotter 和 Power Blotter 膜组将蛋白质转移到 PVDF 膜上（10 分钟）。在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜两次，每次 2 分钟。向放有 PVDF 膜的器皿中加入 10 ml No-Stain 标记溶液，开始标记反应。在旋转平台上进行 10 分钟标记反应。然后在旋转平台上用 20 ml 超纯水洗膜 3 次，每次 2 分钟。使用 iBright 成像仪设置 No-Stain 膜曝光参数（455—485 nm 激发，565—615 nm 发射），然后拍摄图像。
定量凝胶染色
图 5 显示了使用 No-Stain 蛋白标记试剂标记凝胶中的蛋白质时，信号与蛋白含量的线性关系。
图 5.定量凝胶染色。将浓度为 2.5 至 80 µg 的HeLa 裂解液装入 4-12% 的 Bis-Tris Plus 小型凝胶，并用 MES 电泳缓冲液进行电泳。电泳后，按照凝胶中蛋白质标记的 No-Stain 蛋白质标记试剂盒的说明对凝胶中的蛋白质进行标记，并使用 iBright 成像仪对凝胶成像，该成像仪配有透射激发器（490-520 nm）和565-615 nm 发射滤光片。
No-Stain 标记蛋白的信号强度随孵育时间增加
No-Stain 蛋白标记试剂的灵敏度可以微调，以优化低丰度蛋白的检测。延长 No-Stain 试剂孵育凝胶或印迹的时间，信号强度可呈线性增加。或者，当时间有限时，将 No-Stain 蛋白标记试剂的浓度加倍，可在较短的标记时间内获得类似的结果。曝光时间可以轻松设置和调整，以适应实验条件，使用iBright成像系统，将方法检测能力扩展到更广泛的蛋白质表达水平。
点击图片放大
图 6：延长孵育时间可提高 No-Stain 标记试剂的灵敏度。转印后的 PVDF 膜分别与 No-Stain 标记试剂孵育 10、20、30 和 40 分钟，随着时间的延长，信号强度增加。在 Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris 凝胶中上样 40至1.25 μg 的大肠杆菌裂解物，并使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。使用 Invitrogen iBlot 2 快速干转系统和 iBlot 2 转印膜组（P0 方案，7 分钟）将凝胶中的蛋白质转印到小型 PVDF 膜上。用20 ml 超纯水快速冲洗 PVDF 膜，然后在旋转平台上用 10 mL No-Stain 蛋白标记试剂工作液进行孵育。在加入 No-Stain 蛋白标记试剂后 10、20、30 和 40 分钟，使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统采集印迹并分析图像（曝光时间 1000 秒），未对图像进行亮度和对比度调整。曝光时间越长，信号越强，从而提高对低表达蛋白的检测能力（A）。可以观察到归一化信号强度与孵育时间呈线性相关（B）。
将 No-Stain 蛋白标记试剂的浓度加倍，信号强度会增强
点击图片放大
图7.将 No-Stain 标记试剂的浓度加倍可提高检测灵敏度。在 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶中上样加入了 Bolt LDS 样品缓冲液的 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 梯度稀释），然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质直接在凝胶上用 1x 或 2x No-Stain 工作液进行标记。1X No-Stain 工作液根据 No-Stain 蛋白质标记试剂的标准方案制备。1X No-Stain 工作液通过将 No-Stain 活化剂（40μL）和 No-Stain 衍生剂（40μL）的浓度加倍制备。使用Invitrogen iBright FL1500成像系统（曝光时间1000秒）采集凝胶（A）和膜（B）的分析图像，未进行亮度和对比度调整。
No-Stain 标记凝胶的免疫印迹
No-Stain 蛋白标记试剂的功能性适用于蛋白转印和免疫印迹。使用 No-Stain 试剂对蛋白质进行标记不会影响蛋白转印效率，并且与下游蛋白质印迹法兼容，如图 8 所示。
点击图片放大
图8. No-Stain 标记试剂与蛋白转印和免疫印迹兼容。在 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶中上样加入了 Bolt LDS 样品缓冲液的 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 梯度稀释），然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。将凝胶在旋转平台上与 No-Stain 蛋白标记试剂一起孵育 10 分钟。使用 Invitrogen iBlot 2 快速干转系统和 iBlot 2 转印膜组（P0 方案，7 分钟）将No-Stain标记凝胶中的蛋白转印到小型 PVDF 膜上。然后使用特异性一抗对 PVDF 膜进行检测，并使用标记有 Alexa 荧光 800 染料的二抗检测蛋白质。使用 Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的图像。
灵敏度与考马斯染色相当，但所需时间更短
No-Stain 蛋白标记试剂提供了一种快速、灵敏的方法，用于在凝胶和膜上可视化蛋白，无需冗长的脱色步骤和使用甲醇。
点击图片放大
图9.No-Stain 标记试剂的灵敏度与考马斯染色相当。在 Invitrogen Bolt 4-12% Bis-Tris Plus 凝胶中上样加入了 Bolt LDS 样品缓冲液的 A431 裂解物（20 μg 至 20 ng 梯度稀释），然后使用 MES SDS 电泳缓冲液进行电泳分离。蛋白质条带用 No-Stain 蛋白标记试剂或考马斯亮蓝染料标记。使用Invitrogen iBright FL1500 成像系统（曝光时间 1000 秒）采集未经亮度和对比度调整的图像。此外，No-Stain 结果图像的曝光时间可以增加，以便与考马斯蓝相比，更好地检测丰度更低的蛋白裂解物。
No-Stain蛋白标记试剂与化学发光和荧光检测体系兼容。因此，您可以继续使用实验室已有的酶标二抗。在使用荧光抗体偶联物设计实验时，重要的是选择与免染型标签的激发和发射光谱不重叠的荧光团，当 No-Stain 标签与赖氨酸残基共价结合时，在约 488 nm 光源激发下，在约 590 nm 处发光。荧光基团选择取决于荧光成像仪的滤光片组。
您可以将二抗荧光偶联物的激发和发射光谱与No-Stain标签的激发和发射光谱进行比较，以评估与当前抗体偶联物的兼容性。图 6 显示了共价结合的 No-Stain 标签的激发和发射光谱。
表 1.与 No-Stain 蛋白标记试剂和 iBright FL1500 成像系统兼容的荧光二抗。
| Alexa Fluor 偶联物 | 激发/发射 (nm) | Alexa Fluor 二抗 |
|---|---|---|
| Alexa Fluor 635 | 621/639 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 647 Alexa Fluor Plus 647 | 650/665 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 660 | 660/689 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 680 Alexa Fluor Plus 680 | 679/702 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 700 | 702/724 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 750 | 749/775 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor 790 | 784/814 | 查看抗体货号 |
| Alexa Fluor Plus 800 | 777/794 | 查看抗体货号 |
点击放大图片
图 10.共价连接的 No-Stain 标签的激发和发射光谱。共价键连接的 No-Stain 标签的激发最大值约为 488 nm，发射最大值为 590 nm。光谱显示， No-Stain 标签的信号可以使用紫外或荧光光源成像，并且可以使用各种发射滤光片捕获信号。
表1列出了在使用 iBright FL1500 成像系统成像时与共价连接的 No-Stain 标签兼容的荧光基团的部分列表。任何偶联物都可以单独与 No-Stain 标签和 iBright 成像仪一起使用。如果使用两种荧光基团和 No-Stain 蛋白质标记试剂进行多重标记，则从 600 nm 范围内选择一种荧光团，从 700 nm 范围内选择另一种荧光团，以便每种荧光团都可以通过不同的 iBright 发射滤光片成像。
表 1.与 iBright FL1500 成像系统一起使用 No-Stain 蛋白标记试剂时兼容的荧光二抗。
参考文献
- Paramanantham, A., Asfiya, R., Das, S., & Mccully, G. (2023)。No-stain protein labeling as a potential normalization marker for small extracellular vesicle proteins.（ No-Stain 蛋白质标记作为小细胞外囊泡蛋白质的潜在归一化标记。）Preparative Biochemistry & Biotechnology, 0(0), 1–11.
- Lazcano, P., Schmidtke, M. W., Onu, C. J., & Greenberg, M. L. (2022).(2022) Phosphatidic acid inhibits inositol synthesis by inducing nuclear translocation of kinase IP6K1 and repression of myo-inositol-3-P synthase。（磷脂酸通过诱导激酶 IP6K1 的核易位和抑制肌醇-3-P 合酶来抑制肌醇的合成。）Journal of Biological Chemistry, 298(9), 102363.
- Taylor, S. C., Murai, L. K. R., Crobeddu, B., & Plante, I. (2022).A critical path to producing high quality , reproducible data from quantitative western blot experiments.（从定量蛋白质印迹实验中获取高质量、可重复数据的有效途径。）Scientific Reports.
- Matassa, D. S., Criscuolo, D., Avolio, R., Agliarulo, I., Sarnataro, D., Pacelli, C., Scrima, R., Colamatteo, A., Matarese, G., & Capitanio, N. (2022).Regulation of mitochondrial complex III activity and assembly by TRAP1 in cancer cells.（TRAP1 对癌细胞中线粒体复合物 III 活性和组装的调节。）Cancer Cell International, 22(402), 1–18.
相关资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。