细胞裂解和蛋白质提取概述

去垢剂是这样一类分子，它们的独特特性使得操纵（破坏或形成）生物样品中分子之间疏水-亲水相互作用成为可能。在蛋白质研究中，使用去垢剂在亲和纯化方法和免疫测定方法中裂解细胞（释放可溶性蛋白质）、增溶膜蛋白和脂质、控制蛋白质结晶、防止非特定结合，并且用作电泳中的添加剂。

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每胶束的去垢剂单体数目（团聚数）以及高于之则胶束形成的去垢剂浓度范围（称为临界胶束浓度，CMC）是每种具体去垢剂专有的特性（参见表）。临界胶束温度 (CMT) 是胶束可以形成的最低温度。CMT 对应于所谓的浊点，因为去垢剂胶束在低于 CMT 的温度形成晶态悬液，并且在高于 CMT 的温度再次清澈。

去垢剂特性受诸如浓度、温度、缓冲液 pH 和离子强度与各种添加剂的存在情况等实验条件影响。例如，某些非离子型去垢剂的 CMC 随温度升高而降低，而离子型去垢剂的 CMC 随添加反离子而降低，原因是带电头部基团之间静电排斥作用减少。在其他情况下，添加剂如脲有效地破坏水结构并造成去垢剂 CMC 降低。通常，随离子强度渐增出现团聚数显著升高。

去垢剂可能相对于蛋白质结构呈变性或非变性。变性去垢剂可是阴离子型，如十二烷基硫酸钠 (SDS) 或阳离子型，如乙基三甲基溴化铵。这些去垢剂通过破坏蛋白质-蛋白质相互作用完全破坏膜并使蛋白质变性。非变性去垢剂可以分为非离子型去垢剂，如 Triton X-100 ，胆盐（如胆酸盐）和两性离子型去垢剂（如 CHAPS)。

蛋白质提取中使用的常见去垢剂

常用去垢剂的性能

^‡Agg.#= 团聚数，即每个胶束的分子数目。

决定生物样品中分子行为和相互作用的主要因素是其亲水性或疏水性。大多数具有带电荷或极性官能团的蛋白质和其他分子可溶（或可溶混）于水中，因为它们参与水的成氢键高度有序分子间结构。其他一些蛋白质（或至少部分蛋白质）以及脂肪和脂质，缺乏极性或带电官能团；因此，它们从水与其他极性分子的有序相互作用中被逐出，并且倾向于按照极性环境接触表面积最小的结构缔合在一起。非极性分子在水溶液中的这种缔合通常称为疏水吸引，但更准确地理解为从亲水环境中逐出。

生物膜的形成和稳定性主要来自于磷脂的疏水吸引，这些磷脂形成双层片状物，该片状物具有在片状物厚度范围内取向的疏水性脂质"尾部"以及指向外部含水和内部含水环境的极性"头部"基团。膜蛋白完全跨越膜厚度或根据其疏水氨基酸侧链和亲水性氨基酸侧链及其他官能团的结构嵌于膜的一侧。

一般，中等浓度的温和（即非离子型）去垢剂损害细胞膜的完整性，因此便利细胞裂解及提取可溶性蛋白（往往处于天然形式）。使用其他缓冲条件，各种去垢剂可以在足够与孤立的磷脂和胞膜蛋白形成混合型胶束的浓度，在膜双层间有效渗透。

基于去垢剂的细胞裂解。变性和非变性 细胞裂解试剂 均可用于蛋白质提取方法。

变性去垢剂（如 SDS）在低于 CMC 的浓度结合至（疏水性）膜蛋白和（水溶性、亲水性）非膜蛋白（即作为单体）。反应为平衡驱动型直至饱和为止。因此，游离单体浓度决定了去垢剂浓度。SDS 结合呈协同性（即，结合一分子 SDS 增加另一个 SDS 分子将与该蛋白质结合的概率），并且把大多数蛋白质改变成其长度与分子量成比例的刚性棒状物。

Triton X-100 等非变性去垢剂具有不渗入水溶性蛋白质的刚性、庞大非极性头部；因此，它们通常不破坏水溶性蛋白质的天然相互作用和结构，并且没有协同结合特性。非变性去垢剂的主要作用是与膜蛋白的疏水部分缔合，从而赋予这些蛋白质可溶混性。

在低于 CMC 的浓度，去垢剂单体与水溶性蛋白质结合。高于 CMC 时，去垢剂与蛋白的结合与去垢剂分子自我缔合成胶束发生竞争。因此，蛋白质结合的去垢剂单体并不随升高去垢剂浓度超出 CMC 而有效增加。

去垢剂单体通过分配入膜双层中增溶膜蛋白。随着去垢剂量渐增，膜经历不同的增溶阶段。起始阶段是膜裂解或破裂。在去垢剂:膜脂质摩尔比 0.1:1 至 1:1，脂质双层通常保持完整，但出现一些膜蛋白的选择性提取。升高该比率至 2:1，发生膜增溶，产生混合型胶束。这些胶束包括磷脂-去垢剂胶束、去垢剂-蛋白质胶束和脂质-去垢剂-蛋白质胶束。在比率 10:1，所有的天然膜脂质:蛋白相互作用均有效地交换成去垢剂:蛋白相互作用。

为最佳提取蛋白质所需的去垢剂量取决于 CMC、团聚数、温度和膜与去垢剂的性质。增溶缓冲液应当含有足以提供大于一个胶束/膜蛋白分子的去垢剂，以帮助确保单个蛋白分子隔离于单独胶束中。

用于细胞裂解的去垢剂。用于蛋白质提取的变性去垢剂和非变性去垢剂的主要特征。

尽管去垢剂从数个商业来源可获得例行用于许多研究实验室中，但去垢剂纯度和稳定性的重要性并未得到广泛理解。去垢剂通常含有来自其制造过程的痕量杂质。一些杂质中某些、尤其大多数非离子型去垢剂中存在的过氧化物，会摧毁蛋白质活性。此外，暴露于空气或紫外线时，几个类型的去垢剂轻易地氧化，从而造成它们丧失作为增溶剂的特性和效力。Thermo Scientific Surfact-Amps 去垢剂溶液 提供高纯度、低过氧化物含量的在氮气下透明玻璃安瓿中包装的去垢剂。为所有去垢剂应用提供便利、优质和一致性。

然而对于初始裂解细胞或提取膜蛋白，使用去垢剂可能为必要且有益，但后续采用已提取蛋白质的应用或实验可能需要移除部分或全部去垢剂。例如，尽管许多水溶性蛋白质在去垢剂增溶形式下有功能，但作为原生脂质相互作用已遭破坏的结果，膜蛋白往往因去垢剂增溶而修饰和失活。在某些此类情况下，通过用磷脂或其他膜样脂质混合物替换去垢剂使膜蛋白重构入双层膜时，膜蛋白的功能恢复。

如果将某个独立的蛋白质首先纯化并随后重构入人工膜（尽管膜中恢复天然定向是一项重大挑战），则可以孤立地研究该蛋白质的功能。即使蛋白质功能恢复不是问题，可能仍需要在样品中降低去垢剂浓度，以使该样品相容于蛋白质定量或凝胶电泳。

可以尝试通过多种方式移除去垢剂。透析有效地移除具有极高 CMC 极高和/或低团聚数的去垢剂，如 N-辛基葡萄糖苷。不能透析 CMC 低和团聚数高的去垢剂，因为大多数去垢剂分子将于太大以致不能穿过透析膜孔扩散的胶束中；仅可以透析出过量的单体。使用适当条件选择性结合并洗脱目标蛋白的离子交换色谱是另一种移除去垢剂的有效方法。还可使用蔗糖密度梯度分离。

1. Walker JM (2009) The Protein Protocols Handbook.第 3 版.New York (NY): Springer-Verlag New York, LLC.
2. 技术窍门：从蛋白质样品移除去垢剂