什么是新一代高通量测序技术？- 赛默飞

新一代高通量测序技术简介

新一代高通量测序（NGS）指的是近年来出现的 DNA 和 RNA 测序技术，相较于以往方法具有多项优势。NGS 使科学家和研究人员能够并行对核酸片段进行高通量测序，通常用于识别与疾病或其他生物学现象相关的遗传变异。

NGS 常被称为高通量、海量并行或深度测序，因为它可同时测定数百万条 DNA 或 RNA 片段的核苷酸序列，从而深入揭示遗传信息。

与早期的 DNA 测序方法（如Sanger测序）相比，NGS 在测序速度、通量和准确性方面皆有提升，推动了生物学研究的突破性发现。过去十年内，NGS 的检测成本显著下降；自动化技术用于简化工作流程中最繁琐的环节，也使 NGS 更易于实施，从而使全球更多实验室在多种应用中能够采用该技术。

近年来，NGS 检测已在多种应用场景中广泛采用，其应用范围与实用性仍在持续增长。NGS 改变了人们对从特定 DNA 序列和遗传变异中可获得洞见的期望，随着更多创新与发展，NGS 有望在分子生物学更多领域继续推广。

本文概述了 NGS 工作流程的主要步骤、NGS 的主要应用领域及其相对于其他方法的优势，并在结尾提供若干关于如何开始开展 NGS 检测的资源。

NGS 工作流程步骤概览

Step 1: 分离并纯化核酸

核酸纯化是 NGS 工作流程的关键环节。该过程通常自裂解步骤开始，以释放细胞及细胞核中的 DNA 和 RNA。随后可将样本与有机溶剂混合，将核酸与蛋白质及其他杂质分离。接着沉淀核酸并在缓冲液中重悬。提取完成后，可采用多种方法测定 DNA 的浓度与样本的纯度。核酸纯化既可手工操作，也可使用自动化液体处理系统；自动化方法能减少人为误差并适合高通量实验室，而手工方法为小规模或特殊应用提供更高灵活性。

核酸分离时的一些注意事项：

手工与自动化纯化：手工纯化由技术人员使用试剂盒和试剂提取 DNA 和 RNA，需具备湿实验操作的培训和专业技能。自动化系统可用于简化纯化流程，提高通量与重复性，因此对许多实验室有益。

测定 DNA/RNA 质量：DNA/RNA 的质量评估对测序准确性至关重要。分光光度法可用于测定纯度与浓度，而荧光法提供更灵敏的定量。高质量的核酸支持下游应用的可靠性。

Step 2: NGS 文库制备

文库制备是指将核酸样本转化为可供测序的样本所采用的方法集合。该过程通常被视为 NGS 工作流程中最费时且具有挑战性的部分之一。NGS 文库制备包含多个关键步骤，例如扩增目标序列、片段化、接头连接、选择特定片段长度、定量与混样。并非所有描述的步骤都必需，且可能需要附加步骤。例如，RNA‑seq 需要通过逆转录将 RNA 转换为 cDNA。无论采用何种具体方法，正确的文库制备对准确且高效的测序至关重要，因此是 NGS 工作流程的关键环节。

NGS 文库制备涉及的一些重要步骤包括：

扩增目标：对于某些类型的 NGS（例如基于扩增子的目标测序），通过扩增可富集特定的 DNA/RNA 序列，确保有足够的起始物用于测序。聚合酶链式反应（PCR）等技术常用于选择性扩增感兴趣的区域。

片段化：许多 NGS 工作流程（例如全基因组测序）会将核酸打断为较短片段以便测序。可通过机械剪切、酶切或超声破碎实现，产生适合文库构建的最佳尺寸片段。

接头连接：接头连接将短 DNA 序列（接头）连接到被打断的 DNA/RNA 片段两端。这些接头对于与测序平台结合至关重要，并且在测序过程中允许对片段进行识别和扩增。

大小选择：大小选择步骤将 DNA/RNA 片段处理为特定大小范围，有助于提高测序效率和准确性。常用技术包括凝胶电泳或基于磁珠的方法以选择合适大小的片段。

文库定量：文库定量用于测定已制备文库中 DNA/RNA 片段的浓度。准确定量对获得最佳测序性能至关重要，通常使用 qPCR 或荧光法（fluorometric methods）来完成。

文库合并：文库合并将多个样本合并到一次测序运行中，以提高通量和成本效益。为确保从测序输出获得每个样本所需的数据量，需要对每个文库进行仔细定量和均衡。

手工与自动化文库制备：手工文库制备涉及大量手工步骤，耗时且易产生变异。自动化系统可标准化流程，提高效率、重现性和通量，适用于大批量测序项目。

第3步：测序

NGS 仪器可将纳克（ng）级的 DNA 或 RNA 转换为 GB 级数据。流程通常从运行规划开始，用以初始化仪器并设置如片段长度和样本多重化等参数。随后将 DNA 文库附着于固体基底（例如微球或流动池（flow cell）），并与必要的试剂和溶液一起装入仪器。常见的测序方法为合成测序（SBS），即通过掺入带标记的核苷酸并检测每次掺入事件来读取核苷酸序列。碱基识别（base calling）将原始信号转换为称为“reads”的序列读数，并生成包含所有序列读数及反映测序置信度的质量指标的文件。还会提供测序统计以汇总运行性能。输出文件随后可用于下游分析。

测序过程中一些关键步骤包括：

运行规划：运行规划包括设置测序参数，如样本加载、测序化学体系和运行时长。合理规划有助于获得最佳数据质量并高效利用测序资源。

克隆扩增：克隆扩增生成每个 DNA 片段的多个拷贝，形成簇或克隆群。该步骤对测序期间的信号检测至关重要，通常通过乳液 PCR（emulsion PCR）或桥式 PCR（bridge PCR）实现。

合成测序：合成测序通过向固定的模板掺入带标记的核苷酸来读取 DNA 片段的核苷酸序列。每次掺入事件都会被检测，从而确定 DNA 序列。其他用于 NGS 的方法还包括纳米孔测序、单分子实时测序（SMRT）以及连接测序（sequencing by ligation）。

碱基识别与数据输出：碱基识别将原始测序数据转换为核苷酸序列，生成包含质量指标的 FASTQ 文件。该步骤对于评估测序运行的准确性和可靠性至关重要，并为下游分析提供必要信息。

第4步：NGS 数据分析

NGS 数据分析，广义上称为生物信息学，包含一系列计算步骤，旨在从 DNA 测序数据中生成准确且有意义的结果。此类步骤包括去复用、质量过滤、比对参考基因组和变异检测。尽管不同应用间差异较大，NGS 分析可以集成到一个端到端的流水线中并实现自动化执行。下游的分析与可视化工具用于数据解读。报告组件则将结果、指标和可视化内容汇编成综合输出，以便在多个测序运行之间进行比较。