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冷冻电子断层扫描(cryoET)是一项突破性技术,可对细胞结构环境中的生物分子进行 3D 可视化和分析。使用该技术有助于深入理解细胞过程的结构基础,这对于了解细胞功能至关重要。与其他生物成像技术不同,cryoET 是一种无标记的冷冻成像技术,不需要化学固定或染色。取而代之的是,细胞经过快速冷冻(玻璃化)而保留其原始状态。通过这种方式,可将细胞器和单个蛋白质的结构信息与其在细胞内的精确空间排布相关联。这种独特的功能在细胞生物学领域具有巨大潜力,使冷冻电子断层扫描成为一项极具前景的技术。

电子显微镜

冷冻电子断层扫描工作流程

使用冷冻电子显微镜分析细胞内结构。

冷冻断层扫描工作流程

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第 1 步:玻璃化样品制备

细胞按照常见的方法直接培养在具有碳涂层的电镜载网上。为了保持天然细胞环境,细胞不会被染色,而是直接在电镜载网上进行快速冷冻。低温冷冻过程如此之快以至于液态水形成非结晶的玻璃态冰,从而避免了在较慢的冷冻速率下形成晶体造成损害。快速冷冻过程保留了细胞的超微结构。使用赛默飞世尔科技 Vitrobot 系统以半自动方式进行样品冷冻。

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第 2 步:通过荧光定位

在复杂的细胞自然环境中,定位感兴趣的结构是非常困难的。这种情况下,可以使用冷冻关联显微镜,如徕卡 Cryo CLEM 系统冷冻荧光光学显微镜来确定感兴趣的目标结构。在冷冻荧光显微镜成像期间,专门设计的冷冻样品载物台使样品始终保持玻璃化状态。玻璃化样品找到目标区域以后,连同其坐标被转移到 Thermo Scientific Aquilos Cryo-FIB(冷冻聚焦离子束电子显微镜)专用的盒式系统中,以保护样品免于污染。

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第 3 步: 离子减薄

在徕卡 Cryo CLEM 系统中先选择,然后将样品转移至 Thermo Scientific Aquilos Cryo-FIB,专用的 Cryo-DualBeam 冷冻双束电子显微镜进行离子减薄。Aquilos Cryo-FIB 结合了扫描电子束显微镜(SEM)和聚焦离子束显微镜(FIB)两种功能。电子束用于样品成像,离子束用于从玻璃化细胞中精确移除材料。通过关联显微镜定位之后,聚焦离子束用于去除目标区域上方和下方的材料,制备足够电子穿透的lamella薄片。冷冻薄片包含感兴趣的区域,可以被减薄至 100-200 nm。Aquilos Cryo-FIB 冷冻聚焦离子束没有机械切割。相反,玻璃化样品在经过聚焦镓离子束减薄后,冷冻样品表面被扫描,用溅射法一层一层地去除表面原子(也称为离子束减薄)。样品减薄对于电子断层成像扫描工作流程至关重要,因为只有样品足够的薄时, TEM透射电镜中200-300 keV 电子束才能够穿透样品。与冷冻超薄切片相比,Cryo-FIB 冷冻聚焦离子束减薄是一种简单且易于实现的方法,并且避免了机械切片在低温下固有切割伪影(例如在切割方向上的压缩)。

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第 4 步:冷冻电子断层扫描成像

离子减薄之后,冷冻薄片被转移至 Thermo Scientific Krios Cryo-TEM(冷冻透射电镜)进行冷冻电子断层扫描成像。这个过程通过将样品在载物台上进行连续不断的倾转来完成。然后,将单个投影图像通过一种称为反向投影的过程进行计算组合,从而生成三维断层扫描图像。

CryoET visualization and structural analysis

第 5 步:可视化和结构分析

通过 Thermo Scientific Amira 软件(用于高级可视化和分析的通用 2D-5D 平台),可采用各种方式对显现细胞结构的 3D 断层扫描图像进行分割和着色,以增强其显示效果和呈现水平。从断层扫描图像中,可以计算提取出包含感兴趣结构的小数据子集,并对其进行图像处理。图像处理使研究人员能够在保持最可能结构的同时实现纳米级的分辨率。

冷冻电子断层扫描 - 工作原理

冷冻电子断层扫描 - 工作原理

产品

仪器卡片原件样式表

Krios G4 Cryo-TEM

  • 改进的人体工程学
  • 可更轻松放进新建或现有的实验室
  • 极大提高生产率和自动化水平
  • 用于高分辨率 3D 重构的最佳成像质量

Aquilos 2 Cryo-FIB

  • 可自动生成多个薄片
  • 利用提取纳米操纵器锁定并提取感兴趣的结构
  • 用于高分辨率断层扫描的 3D 可视化

Vitrobot 系统

  • 全自动样品玻璃化
  • 滤纸夹吸装置
  • 半自动化载网转移
  • 高样品通量

Amira 软件
生命科学

  • 探索 2D-5D 生物成像数据
  • 识别和理解结构
  • 获取统计信息
  • 分享报告和精彩动画

Auto Slice 和 View 4.0 软件

  • DualBeam 自动连续切片
  • 多模式数据采集(SEM、EDS、EBSD)
  • 实时编辑功能
  • 基于边缘的剪切放置

Maps 软件

  • 获得大面积的高分辨率图像
  • 轻松发现感兴趣区
  • 自动化图像采集过程
  • 关联不同来源的数据

Tomography 5
软件

  • 自动化多位点批量断层扫描
  • 自动盒式映射
  • 可达到最佳电子剂量的剂量对称倾斜方案
  • 与 Selectris 成像过滤器完全集成

Falcon 4i 直接电子检测相机

  • 高吞吐量,每小时可获得更多图像
  • 无与伦比的成像质量和高DQE
  • 用EER进行无损数据压缩
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