冷冻电镜样品制备

高质量蛋白质样品制备是任何成功结构生物学试验的基础。对于冷冻电镜(cryo EM),生物物理方面的参数,如成分、纯度、均匀性和稳定性,以及生物化学活性,极大地有助于制备高质量的cryo EM网格,但它们也会显著影响后续计算重建的分辨率。从蛋白质表达开始,然后对表达的蛋白质进行增溶和稳定,随后进行纯化和除杂,赛默飞世尔科技提供了多种解决方案,可在电镜网格上冷冻样本之前实现最高样品质量。


按照以下 5 个步骤成功制备冷冻电镜样品

开始进行单颗粒分析

想了解如何为冷冻电镜制备样品或如何操作冷冻电镜?访问电镜学习平台,其中包含超过 70 小时的理论讲座和视频。

您对冷冻电镜样品制备的实践经验感兴趣吗?试试Thermo Scientific VitroEase Cryo-EM 培训套件。该玻璃化入门套件包括您立即开始初次准备电镜网格所需的一切,包括详细的说明手册。

下载适用于Android或iOS的 Scientific Workflows 应用程序,获取逐步讲解的可视化工作流程指南。

用于结构生物学的蛋白质制备

任何高分辨率冷冻电镜结构解析都始于良好的蛋白质制备。查看我们的蛋白质样品制备电子学习课程,了解更多关于冷冻电镜蛋白质样品高质量制备信息。

想要进一步优化您的蛋白质生产、纯化或生化性质吗?我们的样品制备方法页面包含按样品类型和方法组织的各种蛋白质分析技术。

样品纯化后,重要的是评估纯化质量是否适合进一步的电镜分析。标准的生化方法并不完全足够,因为完整复合物的溶液实际上可以由组分不同的亚复合物或结构不同的构象的混合物组成。

负染透射电镜

负染透射电镜分析是一种在电子显微镜下评估纯化生物样品质量的便捷方法。该筛选的目的是定性评估粒子组成和构象均匀性,它只能在微观尺度上进行。使用即用型VitroEase Methylamine Vanadate Negative Stain和VitroEase Methylamine Tungstate Negative Stain更轻松地制备负染色样品。

通常此类评估是在简单的侧入显微镜(例如,Thermo Scientific Talos L120C TEM)上进行的,因为筛选通常一次进行一个网格,而实际在显微镜上的耗时很短。

冷冻电镜样品条件

冷冻电镜样品通常使用几微升蛋白质溶液制备,浓度为 50 nM 至 5 μM,具体取决于样品、电镜网格类型和其他使用条件。

冷冻电镜单颗粒分析依赖于计算数千个相同颗粒图像的平均值,因此为了简化结构解析过程,应尽可能降低结构异质性。

虽然单颗粒分析工作流程可通过 3D 分类程序来减轻样品的部分异质性,但仍需对样品进行生化纯化(以分离目标蛋白)。

除了样品异质性之外,冷冻电镜网格上的粒子随机定向也很重要,以便可以从各个方面进行重建。特别是对于不对称结构,取向优势可能会出现问题并严重阻碍结构的分辨率。在这些情况下,添加低浓度的冷冻电镜兼容去垢剂可以帮助解决该问题。此外,去垢剂可以帮助保护玻璃化过程中的蛋白质免受空气-水界面的影响。因为这层界面的影响可能会使不稳定的蛋白质变性,使其不再处于天然状态。

VitroEase 缓冲液筛选试剂盒通过提供一系列与冷冻电镜兼容的缓冲液和洗涤剂,可以轻松地优化您的冷冻电镜样品,这些缓冲液和去垢剂可以直接加标到您的样品中,从而最大限度地减少样品操作和稀释。

电镜样品制备

为了与电镜真空兼容,并将单个粒子锁定在其天然状态,必须冷冻含有样品材料的溶液。为了保存大分子结构,冷冻速度必须足够快,以避免结晶冰的形成;在玻璃化过程中,会形成无定形固体,它对样品结构几乎没有或没有损坏。随后,样品必须一直储存在液氮温度下,以保持在含水的玻璃态状态,从而避免损伤生物样品颗粒。

玻璃化

这一操作会产生冷冻水合样品,样品的各个分子在其中分布良好并嵌入极薄的无定形(玻璃状)冰层中。

整个过程可以使用Thermo Scientific Vitrobot System等半自动柱塞来简化,并且可以与VitroEase Cryo-EM Training Kit结合使用,并提供详细的可视化手册,帮助用户了解玻璃化过程的复杂性。

冷冻电镜中的样品质量

样品玻璃化后,应在开始高分辨率数据采集之前使用诊断性冷冻电镜对其进行评估。这一步骤旨在定性评估样品是否是二维平均分类的潜在目标,并获取初始低分辨率结构信息。在此步骤中,对样品进行预筛选以评估以下特性:

  • 蛋白质浓度、稳定性和分布
  • 整个网格的冰层质量、厚度和均匀性

冷冻电镜筛查

理想情况下,此类筛选在配备自动上样器的冷冻透射电镜系统上进行,因为这样可以在不影响冰质的前提下筛选出多种冷冻条件。Thermo Scientific Glacios Cryo-TEM、Thermo Scientific Tundra Cryo-TEM和Thermo Scientific Talos Arctica Cryo-TEM最适合此类用途。

如果样品通过筛选,则可能需要采集更大的数据量来帮助进一步开展 2D 和 3D 分析。在此阶段仅需中等分辨率 3D 结构 (3Å)。

此外,已有数据表明,配备直接探测器相机的 200 kV 冷冻透射电镜可以产生高分辨率 (3 Å) 数据。

Glacios、Tundra和Talos Arctica Cryo-TEM 显微镜非常适合此类数据采集,并可提供与更高分辨率的Krios Cryo-TEM 强大且无污染的设计连接。这实现了在所有配备 Autoloader 的仪器之间交换 AutoGrid。

开始进行单颗粒分析

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用于结构生物学的蛋白质制备

任何高分辨率冷冻电镜结构解析都始于良好的蛋白质制备。查看我们的蛋白质样品制备电子学习课程,了解更多关于冷冻电镜蛋白质样品高质量制备信息。

想要进一步优化您的蛋白质生产、纯化或生化性质吗?我们的样品制备方法页面包含按样品类型和方法组织的各种蛋白质分析技术。

样品纯化后,重要的是评估纯化质量是否适合进一步的电镜分析。标准的生化方法并不完全足够,因为完整复合物的溶液实际上可以由组分不同的亚复合物或结构不同的构象的混合物组成。

负染透射电镜

负染透射电镜分析是一种在电子显微镜下评估纯化生物样品质量的便捷方法。该筛选的目的是定性评估粒子组成和构象均匀性,它只能在微观尺度上进行。使用即用型VitroEase Methylamine Vanadate Negative Stain和VitroEase Methylamine Tungstate Negative Stain更轻松地制备负染色样品。

通常此类评估是在简单的侧入显微镜(例如,Thermo Scientific Talos L120C TEM)上进行的,因为筛选通常一次进行一个网格,而实际在显微镜上的耗时很短。

冷冻电镜样品条件

冷冻电镜样品通常使用几微升蛋白质溶液制备,浓度为 50 nM 至 5 μM,具体取决于样品、电镜网格类型和其他使用条件。

冷冻电镜单颗粒分析依赖于计算数千个相同颗粒图像的平均值,因此为了简化结构解析过程,应尽可能降低结构异质性。

虽然单颗粒分析工作流程可通过 3D 分类程序来减轻样品的部分异质性,但仍需对样品进行生化纯化(以分离目标蛋白)。

除了样品异质性之外,冷冻电镜网格上的粒子随机定向也很重要,以便可以从各个方面进行重建。特别是对于不对称结构,取向优势可能会出现问题并严重阻碍结构的分辨率。在这些情况下,添加低浓度的冷冻电镜兼容去垢剂可以帮助解决该问题。此外,去垢剂可以帮助保护玻璃化过程中的蛋白质免受空气-水界面的影响。因为这层界面的影响可能会使不稳定的蛋白质变性,使其不再处于天然状态。

VitroEase 缓冲液筛选试剂盒通过提供一系列与冷冻电镜兼容的缓冲液和洗涤剂,可以轻松地优化您的冷冻电镜样品,这些缓冲液和去垢剂可以直接加标到您的样品中,从而最大限度地减少样品操作和稀释。

电镜样品制备

为了与电镜真空兼容,并将单个粒子锁定在其天然状态,必须冷冻含有样品材料的溶液。为了保存大分子结构,冷冻速度必须足够快,以避免结晶冰的形成;在玻璃化过程中,会形成无定形固体,它对样品结构几乎没有或没有损坏。随后,样品必须一直储存在液氮温度下,以保持在含水的玻璃态状态,从而避免损伤生物样品颗粒。

玻璃化

这一操作会产生冷冻水合样品,样品的各个分子在其中分布良好并嵌入极薄的无定形(玻璃状)冰层中。

整个过程可以使用Thermo Scientific Vitrobot System等半自动柱塞来简化,并且可以与VitroEase Cryo-EM Training Kit结合使用,并提供详细的可视化手册,帮助用户了解玻璃化过程的复杂性。

冷冻电镜中的样品质量

样品玻璃化后,应在开始高分辨率数据采集之前使用诊断性冷冻电镜对其进行评估。这一步骤旨在定性评估样品是否是二维平均分类的潜在目标,并获取初始低分辨率结构信息。在此步骤中,对样品进行预筛选以评估以下特性:

  • 蛋白质浓度、稳定性和分布
  • 整个网格的冰层质量、厚度和均匀性

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此外,已有数据表明,配备直接探测器相机的 200 kV 冷冻透射电镜可以产生高分辨率 (3 Å) 数据。

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VitroEase Cryo-EM 培训套件

玻璃化培训

使用VitroEase Cryo-EM 培训套件开始制备您的第一个冷冻电镜网格或进一步提升您的样品玻璃化技能。该套件包含开始为您的 Vitrobot 系统制备冷冻电镜网格所需的一切。

Gibco Expi293 表达系统

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蛋白质表达系统,包括藻类、细菌、哺乳动物、昆虫和酵母,易于使用并以高产量输送蛋白质,适用于下游电子显微镜应用。

n-十二烷基-β-麦芽糖苷去垢剂

用于溶解蛋白的去垢剂

有多种去垢剂可供选择,以软包装的液体和固体形式提供,支持从各种样品来源中提取蛋白质。

Pierce 细胞表面生物素化和分离试剂盒

膜蛋白提取与分离

针对膜蛋白分离和富集进行了优化的试剂和试剂盒,适用于各种下游应用。

Pierce 琼脂糖树脂和色谱柱

蛋白质纯化和分离

磁珠、磁性琼脂糖珠、标准和 Superflow 琼脂糖亲和纯化树脂、Applied Biosystem POROS 树脂和其他层析介质,可实现几乎任何规模的蛋白质纯化。

Zeba 脱盐产品

蛋白透析、脱盐、浓缩和小分子杂质去除

用于蛋白质样品去除污染物或缓冲液交换的树脂、离心柱和装置。

Gallery proteins

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应用

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技术

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样品


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产品

Vitrobot 系统

  • 全自动样品玻璃化
  • 滤纸夹吸装置
  • 半自动化载网转移
  • 高样品通量
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