问:什么是 Quantifiler Duo 试剂盒?
答:Quantifiler Duo 试剂盒是一种可用于 DNA 定量的多重 TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测试剂盒,可同时扩增人类和人类男性靶标。


 

问:什么是实时荧光定量 PCR 以及基于该技术的 DNA 定量测定技术可为法医学分析提供哪些优势?
答:实时荧光定量 PCR 指的是在 PCR 进行的同时(即实时),对 PCR 产物进行监测的能力。实时荧光定量 PCR 反应以循环期间首次检测到特定靶标扩增的时间点为特征,而非以在固定循环次数后累积的靶标量为特征。靶标的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加。通过与已知起始拷贝数的 DNA 标准品进行比较,可以可靠地估计未知 DNA 样品的浓度。使用基于 PCR 的定量测定技术可帮助确定样品中可扩增 DNA 的量,并可有效预测每份样品在下游 PCR 检测中的表现。Quantifiler Duo 试剂盒可利用在单一实时荧光定量 PCR 检测中多重分析不同靶标的能力,并可有效估计人类和人类男性 DNA 的总数量。


 

问:Quantifiler Duo 试剂盒可使用哪些人类和男性靶标?
答:人类靶标位于 14 号染色体上的 RPPH1 基因(核糖核酸酶 P RNA 组分 H1)中(位置:14q11.2),男性靶标位于 Y 染色体上的 SRY 基因(位置:Yp11.3)中。


 

问:新扩增子的长度是多少?
答:

靶标标记扩增子大小
人类核糖核酸酶 P RNA 组分 H1 (RPPH1)140 bp
人类男性SRY130 bp
IPC人工模板130 bp

 

问:与现有的 Quantifiler Y 和 Quantifiler Human 试剂盒相比,为什么 Quantifiler Duo 试剂盒的扩增子长度有所增加?
答:选择的扩增子的大小应可提高对 DNA 数量的估计能力,从而对降解样品中的 DNA 量进行更真实的估计,并提高定量测定值与 AmpFℓSTR 试剂盒性能之间的相关性。


 

问:Quantifiler Duo 试剂盒中包含的 DNA 标准品的性质是什么?
答:Quantifiler Duo 试剂盒的 DNA 标准品包括合并人类男性基因组 DNA,可提高稳定性并与法医检材相关。这与在现有的 Quantifiler 试剂盒中使用的细胞系 DNA 有所不同。


 

问:哪些实时荧光定量 PCR 仪器支持 Quantifiler Duo 试剂盒?
答:Quantifiler Duo 试剂盒已经过优化和验证,仅可用于 Applied Biosystems 7500 实时荧光定量 PCR 系统。


 

问:在Applied Biosystems 7500 实时荧光定量 PCR 系统上运行 Quantifiler Duo 时应使用哪个软件版本?
答:实验室可以选择专门设计用于法医学工作流程的新型 HID 实时荧光定量 PCR 分析软件 v1.0,或 SDS 软件 v1.2.3。HID 实时荧光定量 PCR 分析软件 v1.0 可提供 Quantifiler Duo 特定 M:F 标记以及 SDS 软件 v1.2.3 所不具备的其他高级数据分析功能。


 

问:当发布 Quantifiler Duo 试剂盒时,是否会停用现有的 Quantifiler 试剂盒?
答:Quantifiler Duo 试剂盒发布时现有的 Quantifiler Duo 试剂盒将继续可用。


 

问:如果我是现有的 Quantifiler 试剂盒用户,将需要哪种级别的验证才能转换至 Quantifiler Duo 试剂盒?
答:所有实验室均需要进行内部验证,以根据 Quantifiler Duo 检测的结果来确定 STR 扩增的理想 DNA 起始量。


 

问:Quantifiler Duo 试剂盒的动态范围是多少以及该试剂盒是否可以对较低水平的 DNA 进行定量测定?
答:Quantifiler Duo 检测的动态范围为 23 pg - 50 ng/µL,与现有的 Quantifiler 试剂盒相同。Quantifiler Duo 试剂盒将可检测所含 DNA 浓度低于 23 pg/µL 的样品;灵敏度研究已证明其可检测 DNA 浓度低至 6 pg/µL 的样品。然而,使用任何基于扩增的定量测定方法检测 <100 pg/µL 均受随机效应影响,从而可能导致定量测定结果和扩增成功的预测出现不确定性。对于任何定量测定值小于或等于 100 pg/µL 的样品,无论 DNA 浓度如何,均需使用最大 DNA 量用于靶向 1 ng 的 STR 扩增。


 

问:如何使用 Quantifiler Duo 试剂盒得到的结果计算混合源样品中的男性与女性 DNA 的比例?
答:Quantifiler Duo 试剂盒可用于定量测定生物样品中的总人类和人类男性 DNA 的量。男性与女性 DNA 的比例可采用以下公式计算:

男性 DNA: 女性 DNA 比例=
男性 DNA: (人类 DNA - 男性 DNA)
------------- ---------------------------------
男性 DNA 男性 DNA
(以上公式中所有量的单位均为 ng/µL)

例如,假设:

男性 DNA 浓度= 2 ng/µL
人类 DNA 浓度= 8 ng/µL


男性 DNA: 女性 DNA 比例 = 2/2: (8-2)/2 = 1:3

 

问:如何能够知道混合样品中存在的男性 DNA 与女性 DNA 比例,从而确定理想的样品分析途径?
答:了解混合样品中男性与女性 DNA 的比例可帮助分析员确定常染色体或 Y-STR 分析是否能够提供有关男性组分的较大信息量。一般而言,对于显示男性:女性 DNA 比例达 1:10 的样品,通常可使用 Identifiler 试剂盒等常染色体 STR 系统观察和解读男性和女性组分;对于显示男性:女性 DNA 比例大于 1:10 的样品,如果使用常染色体 STR 试剂盒进行分析,则次要组分可能会低于仪器平台的检测水平,因此最好使用 Y-STR 系统(如 Yfiler™ 试剂盒)分析男性组分。每个实验室均应使用常染色体扩增系统确定混合样品中男性组分的最低检测水平,并确定可证明 Y-STR 分析更成功的临界值。这可以在 Quantifiler Duo 试剂盒的内部验证研究中实现。

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