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筛查支原体污染是每个开展细胞培养的实验室必须进行的检测。培养细胞被支原体污染后会改变细胞生理性质，影响实验结果。支原体污染无法通过肉眼检查细胞来发现，也不能通过向培养基中加入抗生素控制。常规的检测方法包括PCR和酶活性测定，这些方法需要花费大量的金钱或时间，而且灵敏度和特异性不一。

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高内涵检测支原体污染

使用高内涵筛选和明场图像检测细胞培养物中的支原体污染，可以快速、自动化检测和定量分析细胞内的核外DNA。根据组织细胞人工培养协会推荐的支原体检测程序 (TCA第75361号程序)，用适当的容器 (如96孔板、腔室玻片) 培养细胞，然后用Hoechst染色 (Hoechst可与dsDNA结合)，并检查细胞培养体系中有无大小均匀的核外DNA。

应用ArrayScan 高内涵筛选系统进行明场和荧光多模式成像，可以使支原体检测成为自动化的常规程序，用于监测实验室中细胞培养的质量。明场图像用于对细胞内支原体的位置进行视觉确认。通过将明场通道与所有包含DNA染料Hoechst的高内涵分析结合，每次进行ArrayScan分析时都可以快速检测的方式进行支原体检测和定量。

用目标基因转染HeLa细胞。使用DMEM (含高糖)、L-谷氨酰胺 (2 mM)、丙酮酸钠 (1 mM)、10% FBS和G418 (0.3 mg/mL) 培养细胞，添加或不添加青霉素-链霉素。本研究所用细胞均处于传代15至18次之间。将细胞按照每孔5,000个细胞的密度接种于96孔板上，每孔100 μL培养基。加板盖后放入培养箱中过夜，使细胞贴壁。第二天向每孔加入10 μL Hoechst 33342 (终浓度2 μg/mL，Invitrogen)。用100 μL PBS洗涤一次细胞，分析前向每孔中加入100 μL PBS。使用ArrayScan 及明场采集图像，并使用 Compartmental Analysis BioAppliaction进行图像分析。

图1：对存在支原体污染的HeLa细胞进行多模式图像采集

图1显示了使用ArrayScan 和明场模块拍摄的被支原体污染的HeLa细胞图像，并使用Compartmental Analysis BioApplication进行图像分析。图A和B为同一视野图像，图C和D为图A中白框内图像的放大图。图A和C显示了经Hoechst 33342染色的细胞核以及通过Compartmental Analysis BioApplication识别的核外DNA (黄色图层信号)。图B和D为同一明场图像，以及通过BioApplication在Hoechst通道识别的支原体图层信号 (标记为红点)。

图2：对未被污染的HeLa细胞进行DNA Hoechst染色，并对细胞外DNA进行定量检测

ArrayScan 的多模式功能使用户可以确认核外DNA是整个细胞的一部分还是培养基中存在细胞外支原体 (如图2中C和D所示)。尽管Hoechst染色后用PBS洗涤过培养孔，但视野内仍存在细胞外支原体，如图C和D中红色箭头所示。图C为Hoechst染色，其中蓝色图层信号标注的为细胞外DNA，图D所示明场图像显示没有细胞带有Hoechst阳性染色。在图2的A和B中，HeLa细胞核外或细胞外均无Hoechst染色。图A为Hoechst染色，蓝色叠加线表示分析目标，图B为Hoechst通道图像，如果存在核外DNA，则会在该图中显示。

图3：在细胞水平对正常HeLa细胞群体和污染群体的Hoechst 33342染色进行分析

根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果（未展示），确认存在支原体污染。图3的图表显示核外点计数超过临界值的细胞百分比，并通过正常HeLa细胞百分比进行标准化。

结论

  • 通过多模式高内涵成像方法可方便地检测细胞培养物中的支原体污染。
  • 该方法准确检测出支原体污染并得到PCR实验证实。
  • 通过将荧光检测方法和明场成像结合，可以对支原体污染进行定量，并确定其与细胞的关系。

参考文献

  1. T.R. Chen. (1976) Microscopic Demonstration of mycoplasma contamination in cell cultures and cell culture media. Tissue Culture Association, procedure number 75361.
  2. Chen (1988) In situ detection of mycoplasma contamination in cell cultures by fluorescent Hoechst 33258 stain. Exp Cell Res 104. pp255-262.
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