通过流式细胞术进行稀有细胞分析——检测稀有事件的分步策略

在研究过程中使用流式细胞术进行稀有事件分析时，关键在于样品量、要获取的事件总数以及识别目的群体的标志物。此外，“下一代”仪器，如 Invitrogen Attune NxT流式细胞仪，具有高速数据采集和高灵敏度检测的特点，可以轻松鉴定稀有细胞，并对其进行表型分析和功能检测。

使用下面这些链接浏览本指南，了解有关流式细胞术分析稀有细胞的三个阶段（实验前阶段、实验阶段和数据分析）的更多信息。

本页内容：

• 实验前阶段
• 实验阶段
• 数据分析
• 评论
• 参考文献

分析前阶段涉及根据稀有群体的预期频率和需要获得的事件数量来决定应使用哪种生物基质来识别稀有细胞。图 1 描述了 泊松统计如何定义多个事件将在固定的时间/空间/体积间隔内发生的概率 [4]。

良好的实验实践建议将 CV 保持在 5% 以下，因此应定义要获取的事件数，以保持尽可能低的 CV [6]。例如，要识别代表 0.01% 的细胞群，应获取 500 万个事件。

表 1.在保证CV值低于5%的情况下，检测阳性率为 0.01% 的细胞亚群所需采集的事件总数。使用稀有事件计算器工具。

给出的数字标准。在这种情况下，可以在将实验样本与一系列对照样本（包括足够的阴性对照）进行比较后确定“阳性”事件，使用标准统计工具计算阳性率 [7]。因此，提高信噪比对于区分阳性群体的信号和背景信号至关重要。此外，由于采集足量事件数至关重要，因此样品浓度和进样流速是关键参数，应适当进行调整以缩短采集时间并避免增加重合事件的发生（参见 BioProbes 第 71 条： 使用流式细胞术检测稀有事件的工具和策略）。重合事件的发生是不确定的，且不提供有价值的信息。此外，获取的重合事件即使在点图中可以根据高度、面积和宽度参数从单个细胞门内去掉部分黏连体，但没有方法能完全去除它们。

因此，为了尽可能地保持数据完整性，应尽量降低重合事件的发生。此外，它还会影响细胞绝对计数，因为包含两个或多个微粒的事件仅计为一个微粒。为了理解重合事件是如何计算的，需要澄清一些决定仪器性能好坏的定义：

1. 最大事件率是仪器在即将一次开始计数两个细胞之前每秒可以记录的事件数
2. 流速是指样品流入仪器的速度；
3. 样品浓度是一定体积中的细胞数量。

有两种方法可以计算流式细胞仪的最大事件率。一种标准的、更准确的方法是将最大事件率定义为所有事件中有 10% 是重合事件时的分析速度率（根据泊松统计），这也是 Attune NxT 流式细胞仪的设计方法。另一种方法是引用电子数据采集系统的最大事件率。使用这种方法设计的系统与重合事件无关，因此在仪器指定的最大事件率下会产生非常高的重合率。

基于此信息，使用 10%重合率并 方法设计的仪器预计其最大事件率为 35,000 个事件/秒。因为重合事件只能被计作单个事件，所以实验时的事件率应低于理论事件率。在采集速度为 35,000 个事件/秒时，事件率有 10% 的差异（按设计原理）。应该注意的是，重合率随着分析速度的增加而增加。低流速流式分析仪的丢失率通常会更高，然而丢失率的高低与分析仪无关，因为分析的是细胞亚群的阳性率而不是细胞亚群的绝对数量（如细胞分选仪）。因此，超过 35,000 个事件/秒的 10% 速率可能是合理的，但是超过 10,000 个事件/秒的 10% 丢失率可能不是合理的。

一旦确定了需要采集的事件数量和实验目的，就需要考虑生物样品的数量。因此，应根据需要分析多少事件来决定所需的血样量。为了进行深入的稀有事件分析，例如需要分析恒定自然杀伤 T (iNKT) 细胞或抗原特异性 T 细胞的表型和功能，应从患者体内至少抽取 30 mL 全血样品。

外在此步骤中，需要确定鉴定细胞所需的标志物，以及根据 实验方案设计中的最佳实践来设计多色方案 [8]。特别注意的是，应该为细胞死活染料和/或 DUMP 通道保留一个通道（第 14 页的“注释”）。

根据实验目的，可能需要或不需预富集待测稀有细胞亚群。富集可以通过使用 Ficoll-Plaque 分离获得 PBMC 或通过血沉棕黄层分离外周血细胞来进行。此外，通过磁性细胞分离对靶细胞进行定量预富集，可快速处理大量样本（10⁶ 至 10⁹个细胞），是增加稀有抗原特异性 T 细胞、iNKT 细胞或循环内皮细胞阳性率相对数量的有效方法[9]。可以通过表征稀有细胞亚群的已知标志物，或通过使用四聚体，或通过分泌细胞因子的细胞进行特异性富集 [10-13]。 

使用抗 CD154单抗可以预富集稀有的抗原特异性 CD4 T细胞。通过在刺激过程中加入荧光偶联的 CD154特异性抗体，该实验与细胞内细胞因子染色完全兼容，可用于长达 24 小时的细胞刺激。最后，另一种可用于富集活化的 CD4+、CD8+或 CD1d+ T细胞的分子是CD137 (4-1BB)，它是 TNFR超家族的成员，已被证明在 16-24 小时的刺激细胞上表达 [6]。短期（6 小时）刺激后对 CD137 和 CD154 的联合分析可能最适合鉴别对同一抗原起反应的常规 T 细胞和调节性 T 细胞 (Tregs) [14]。 

如果富集过程导致稀有细胞损失会产生负面影响，但可以通过去除不需要的细胞，达到富集相关稀有细胞的目的。[15]。便于稀有细胞检测的另一种策略是通过体外扩增的方法增加抗原特异性 T 细胞的数量，即使单个 T 细胞的扩增不仅受其功能状态（例如幼稚、记忆、失能T细胞），也受其他反应性或辅助细胞的影响。因此，很难从原始样品中通过延长体外培养时间获得足够多数量的目的细胞群。此外，扩增细胞的表型和功能可能会因培养条件而发生显著变化 [16, 17]（ 表 2 ）。

表 2.用于检测稀有抗原特异性 T 细胞的富集方法。该表列举了富集抗原特异性 T 细胞的两种方法。直接法主要通过 MHC 多聚体（顶部）直接进行富集；间接法主要通过细胞因子分泌实验、CD154 或/和 CD137 进行富集（底部）。

方案 1. 流式细胞术检测 iNKT 细胞

iNKT细胞是一群特异性表达恒定 Vα24Jα18 TCR的固有免疫样淋巴细胞，它们将CD1d呈递的自身和外源脂质识别为同源抗原。iNKT 细胞的特点是同时表达T 淋巴细胞特异性标志物（CD3、CD4、CD8）和 NK 标志物（CD161、CD56），它们占人类 T 细胞的 0.1-0.001% [18]。根据 CD4 和 CD8的表达情况，成熟的 iNKT 细胞可分为三种功能不同的细胞亚群，即 CD4+CD8-、CD4-CD8- 和 CD4-CD8+ [19] [20]。 

制备PBMC样品

1. 采集至少 30 mlEDTA或肝素抗凝的全血，并在 4 小时内按照标准程序进行外周血单个核细胞 (PBMC) 的分离
   警告：务必使用新鲜采集的血液。由于受体脱落、受体下调或细胞死亡，前一天采集的血液可能会对结果产生不利影响。
2. 用 DPBS 1:1 稀释血液，并在 50 mL离心管中将 35 mL稀释全血悬浮液小心地铺到到 15 mL Ficoll-Paque分离液上。
   警告：非常缓慢地执行此步骤，以免破坏 Ficoll 表面。
3. 20°C条件下，样品在不带制动器的旋翼式转子中以 400×g 离心 30 分钟。
4. 吸除上层血浆，使单个核细胞层（淋巴细胞、单核细胞和血小板）在此期间不受干扰。
5. 小心地将单个核细胞层转移到新的 50 mL离心管中。
6. 加入适量DPBS，混匀并在 20°C条件下以 300×g 离心 5 分钟。小心吸除上清液。
   警告：在此步骤中，可能会产生一些沉淀。为避免产生沉淀，可将 0.5% 的牛血清白蛋白 (BSA) 或胎牛血清 (FBS) 添加到 DPBS 并过滤收集的PBMC。
7. 重复步骤 6。
8. 使用 Turk 或台盼蓝进行细胞计数。

抗体染色

9. 准备单染色对照管、FMO 对照管和含有识别目的细胞所需的所有单克隆抗体 (mAbs) 的全染管。
10. 在所有试管中加入相同数量的细胞 - 每个试管中至少有500万个细胞。
    警告：用移液器重悬细胞，必要时进行过滤。
11. 用DPBS+0.5% FBS清洗细胞。在20°C条件下以 300×g 离心 5 分钟，并弃除上清液。
12. 将不同的 mAbs 加入到对应的流式管中（6B11、TCR 7.2、CD3、CD4、CD8、CD161）-根据步骤 8 的浓度结果加入滴定好的相应流式抗体。涡旋试管， 20°C条件下避光孵育 20 分钟。
13. 用 DPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在 20°C条件下以 300×g 离心 5 分钟，并弃除上清液。
14. 重悬细胞使其终浓度为 4-10×106 个细胞/mL，立即上机获取细胞。

CEC是由于内皮损伤而从内膜层脱落的成熟内皮细胞 [21]。不同心血管疾病的发生和发展过程中都可能存在内皮功能障碍。发现这些细胞的一个最大的问题是尚未确定识别循环内皮细胞及其祖细胞的特异性标志物或标志物组合。目前，鉴定内皮细胞最常用的标志物是：DNA、CD34、CD45、CD133、CD31、CD146 和 CD309。具体而言，循环内皮细胞的表型特征为 DNA+、CD34+、CD45-、CD31+、CD133-、CD309+。内皮祖细胞 (EPC)的表型为DNA+、CD34+、CD45dim、CD31+、CD133+、CD309+/- [22-24]。 

方案 2. 外周血细胞中循环内皮细胞的鉴定

1. 采集 30 mlEDTA或肝素抗凝的全血，并在 4 小时内按照标准程序进行外周血单个核细胞的分离。
2. 在旋翼式转子中，在 20°C条件下以 200×g 离心 20 分钟。
3. 吸除上层（血浆），使外周单个核细胞层（淋巴细胞、单核细胞和血小板）在此期间不受干扰。
4. 小心地将单个核细胞层转移到新的 50 mL离心管中。
   警告：此步骤需非常缓慢地使用小容量移液器进行，以便获得大部分单个核细胞，并避免收集过多的红细胞。
5. 像离心管中加入适量红细胞裂解液，混匀并孵育 30 分钟。
6. 在 20°C条件下以 300×g 离心 5 分钟。小心地吸除上清液并重复一次。
7. 使用 Turk 或台盼蓝进行细胞计数。

抗体染色以鉴定CEC和EPC细胞

8. 准备单染色对照管、FMO对照管和包含所有单克隆抗体 (mAb) 的全染试。
9. 在所有流式管中加入至少 500万个细胞。
10. 用 DPBS+0.5% FBS清洗细胞。在 20°C条件下以 300×g 离心 5 分钟，并弃去上清液。
11. 加入相应滴定好的流式抗体（至少包括：CD45、CD34、SYTO16、CD133）。涡旋流式管，并在20°C条件下避光孵育 20 分钟。
12. 用 DPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在 20°C 下以 300×g 离心 5 分钟并弃去上清液。
13. 重悬细胞使其终浓度为4-10×106 个细胞/mL，并立即上机获取细胞。

设置流式细胞仪上机条件

14. 选择分析所需的所有通道并关闭所有其他通道以节省计算机内存。
15. 设置分析所需的所有点图和直方图，并检查荧光溢漏情况。
16. 通过单染管为每个通道设置PMT电压，并创建补偿矩阵。
17. 获取单染管和 FMO 对照管，并检查设门策略。
18. 获取全染管并进行数据分析。用于鉴定iNKT 和 MAIT 细胞表型的设门策略如 图 3 所示，而用于鉴定CEC 和 EPC 的设门策略如 图 4 所示。

即使在数据采集过程中关闭了未使用的参数，由于采集的事件和所用参数的数量，数据文件往往都很大。因此，数据分析需要强大而快速的硬件支持（至少 8gb RAM 和至少 500gb HHD）。补偿和数据分析可以使用相同的获取软件，也可以采集数据后使用 FlowJo 或 FSC Express第三方软件。然而，鉴于流式细胞术的高通量特性以及一次性采集数百万个事件、检测更多参数的能力，不可能采用经典的手动分析技术进行数据分析。因此，流式细胞仪需配备一套能够以更自动、更准确的方式分析、可视化和解释大量细胞数据的软件工具 [25, 26]。 

有几个软件程序（基于主要成分分析，PCA）使用可视化技术作为传统二维点图的替代方案。第一篇关于使用 PCA 分析流式数据的论文发表于2007年；这种方法应用于对不同年龄（年轻、中年和百岁老人）供体的初始和记忆性T细胞进行八色细胞荧光分析 [27]。如今，大多数常用的数据分析平台可以使用 SPADE、FlowMap、FlowSOM、viSNE、PhenoGraph、Scaffold map 和 DREMI-DREVI 等多种工具。这些方法主要应用降维分析或基于聚类的技术[在 [26] 中进行了评论]。用于CEC鉴定的t-SNE分析示例如 图 5 所示。因为可能被许多聚类算法误认为是噪声信号，所以在鉴定非常稀有的细胞亚群时可能存在一些问题。为了识别所有相关细胞群体，可能需要进行详尽的设门策略，经常导致过度聚类，所以仅选择与表型相关的那些特征进行分析。采用传统的聚类算法时，建议仅使用相关标志物进行聚类分析。差异很小或指示与细胞类型鉴定无关的标志物（例如，激活标记）最好被排除在外，因为这些只会对相似性计算产生噪音信号[26]。 

优化信噪比是区分目的细胞群的信号与背景的关键因素。设定阈值去除碎片的影响可能会有所帮助，此外可以使用死活染料去除死细胞、排除黏连体/聚集体/碎片，同时还可使用“DUMP”通道排除与目的细胞无关的其他细胞亚群。此外，还可以监控 “采集时间”参数，以消除采集过程中由管路堵塞或其他可能的一过性问题引起的异常事件（ 图 6 ）。

值得注意的是，为了优化检测结果的灵敏度，需要考虑的另外两个因素是仪器的清洁度和样品的完整性。确保使用的仪器和液体清洁且不含有可能对稀有群体造成错误影响的颗粒，这一点很重要。

从全血中提取PBMC以及从血沉棕黄层获取外周血细胞通常需要一个半小时的时间。抗体染色需要 20 分钟，然后洗涤 5 分钟。因此，根据需要染色的试管数量以及所需的洗涤次数，从样品制备到准备好待采集的细胞之间所需的时间可能约为两个半小时。上机采集时间则取决于仪器、采集速度和体积，以及不同样品之间的残留率（两个样品之间可能需要不同的清洗步骤）。

由于采集足够多的事件对于检测稀有细胞亚群至关重要，因此样品浓度和流速是缩短采集时间的关键因素 - Attune NxT 能够以高达35,000 个事件/秒的速度进行数据采集。例如，要检测阳性率为1%，样本浓度范围为400万，具有 1% CV 的目的细胞（如嗜碱性粒细胞），Attune NxT 只需 33 秒即可完成样本采集；要检测量阳性率为0.1%（如NKT 细胞、iNKT 细胞 & 树突状细胞、循环内皮细胞），样本浓度范围约为 400 万，具有1% CV的目的细胞，Attune NxT 只需 4 分钟 – 采集速度比流体动力学聚焦的流式细胞仪快 10 倍；获取10 个 iNKT 事件所需的时间在 14 到 3 分钟之间。这意味着可以在同一天分析更多样品，从而节省大量时间、人力和相关仪器成本。

我们衷心感谢意大利摩德纳大学和雷焦艾米利亚医学院的 Sara De Biasi 和 Andrea Cossarizza 为本指南做出的宝贵贡献。

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