分子克隆疑难解决指南 | Thermo Fisher Scientific - CN

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您已经努力克隆了自己的目标 DNA 片段——完成了酶切、片段制备和目标插入片段纯化、载体和插入片段连接、细菌转化以及转化菌落的接种。但是当您筛选插入片段时，您却发现有些问题阻碍了您的进展。

你会怎么做？首先，反向追踪实验流程，检查每一步中可能发生的所有问题。如果每一步都使用合适的对照，将使问题排除变得更快和更简单。

以下是我们的技术应用专家团队提出的实用建议，可助您了解如何解决这些分子克隆问题。

插入片段序列错误

分子克隆相关问题

很少或没有转化子

可能原因	建议
细胞接种步骤
细胞量不足	使用制造商推荐的转化细胞接种体积。按需调整细胞稀释度，以获得预期所需的菌落数。热激活后在营养培养基（如， S.O.C 培养基）中复苏感受态细胞，并在接种前留出足够的生长复苏时间（如， 1 小时）。
抗生素使用错误	确保培养基中所用的抗生素与载体的抗性标记相同。
抗生素浓度过高	确认培养基中的抗生素用量正确。
细菌转化步骤
转化效率低	在转化反应中，使用 0.1ng 完整的超螺旋载体 DNA（如， pUC19）检验感受态细胞的转化能力。使用 1 µg超螺旋DNA时，感受态细胞应产生至少 1 x 10⁶ 个转化株。这相当于在转化中使用 0.1 ng 未切割质粒时，可产生约 100 个菌落。对于较长的插入片段（如， >5 kb），请考虑使用电转代替化学转化，以提高转化效率。另请参见转化问题疑难解答。
插入片段有毒性	宿主大肠杆菌菌株可能无法耐受某些克隆序列。请检查目标序列是否具有强大肠杆菌启动子和反向重复序列。如果克隆序列表达的蛋白质对大肠杆菌有毒，请尝试使用具有低表达水平或受到严格调控诱导的启动子。也可考虑使用低拷贝数质粒作为克隆载体。尝试使用其它可耐受重复序列的菌株（如， Stbl2 大肠杆菌）。尝试降低细胞生长环境的温度（30°C 或室温）。这将需要更长时间才能出现菌落。
转化混合物中的连接酶过多	T4 DNA 连接酶的存在可能会降低转化效率。50 µL 感受态细胞和电转感受态细胞使用的连接混合物分别不得超过 5 µL 和 1 µL。
连接步骤
连接效率低	利用对照反应检验连接酶是否还有活性。优化连接反应参数，如插入片段:载体比例、反应时间和反应温度，从而使目标片段的插入最大化。
DNA 质量差	确保插入片段和载体 DNA 片段不含酶切反应残留物（如，活性限制性内切酶）或污染物（如，多余的盐、EDTA、苯酚等），它们可能会抑制连接反应。在连接前，通过凝胶电泳、柱纯化或苯酚:氯仿:异戊醇溶剂萃取法对载体和插入片段进行纯化。
转化混合物中的连接酶过多	T4 DNA连接酶的存在可能会降低转化效率。在连接反应中，连接酶用量不得超过推荐量。如有需要，可在转化前通过氯仿萃取、热灭活或柱纯化等方法灭活 T4 DNA 连接酶。
连接中存在不兼容末端	检查所选限制性内切酶生成的突出端的兼容性。
片段制备步骤
缺少 5′ 磷酸基团	如果使用去磷酸化的载体，应确保插入片段具有连接所需的 5′ 磷酸基团。
平端克隆效果不佳	在平端克隆中，由限制性内切酶生成的突出端可能未得到有效的补平或修整。应对突出端使用最佳的平端化方法。
紫外线损伤DNA	在切割琼脂糖凝胶时，DNA可能被紫外线损失。为了尽量减少紫外损伤，在从凝胶上切割DNA时应使用长波紫外线（360 nm）灯箱，并尽可能缩短曝光时间。如果使用短波（254–312 nm）灯箱，应将 DNA 的曝光时间限制在几秒内，并在透照期间将凝胶保持在玻璃或塑料板上。或者，使用具有更长激发波长（减少损伤）的染料使 DNA 显色。另一种方法是将 DNA 样品上样至两条或更多泳道中。电泳后，仅切下来一条泳道并使用溴化乙锭染色。使用该染色泳道作为从未染色泳道上切割 DNA 的参照。
限制性酶切步骤
酶切效果不理想或酶切不完全	确保限制性内切酶不含可能损伤 DNA 末端的污染性核酸内切酶、核酸外切酶或磷酸酶。使用在最高质量标准下生产的酶进行分子克隆。根据酶生产商的建议进行限制性酶切消化。检查反应条件、缓冲液兼容性和所需辅助因子，以获得最佳酶切结果。在限制性酶切消化后，通过凝胶电泳检验DNA片段，以评估条带大小以及任何不理想的剪切，如模糊或多余的条带。如有需要，可对酶切片段进行测序，以检查切割位点。

许多菌落包含空载体

可能原因	建议
细菌转化步骤
插入片段对细胞有毒性	宿主大肠杆菌菌株可能无法耐受某些克隆序列，从而提高了含空载体细胞的背景。请检查目标序列是否具有强大肠杆菌启动子和反向重复序列。如果克隆序列表达的蛋白质对大肠杆菌有毒，请尝试使用具有低表达水平或受到严格调控诱导的启动子。也可考虑使用低拷贝数质粒作为克隆载体。尝试降低细胞生长环境的温度（30°C或室温）。这将需要更长时间才能出现菌落。尝试使用其它可耐受重复序列的菌株（如，Stbl2 大肠杆菌）。
片段制备（去磷酸化）步骤
载体自连	为减少载体自连，应使用合适的碱性磷酸酶使载体去磷酸化。应确保在去磷酸化后完全灭活或去除碱性磷酸酶。如果使用去磷化载体，去磷酸化反应可能不完全。应通过连接去磷酸化载体并转化到细胞中，进行阴性对照反应。如有需要，可对载体重复进行碱性磷酸酶处理。
限制性酶切步骤
不完全酶切	在琼脂糖凝胶上对酶切载体和插入片段进行凝胶纯化，以评估酶切效率。在转化反应中使用经酶切的、未连接的载体作为反应对照，用于确认载体酶切结果。

许多菌落不含载体

可能原因	建议
细菌接种步骤
抗生素浓度过低	确认抗生素用量正确。
抗生素降解	在加入抗生素之前，使琼脂糖冷却至约 55℃，避免高温诱导抗生素降解而影响其效力。有些抗生素（如氨苄青霉素和四环素）对光敏感。在长期保存时，应将含有光敏性抗生素的平板避光存放。应接种未转化的感受态细胞作为阴性对照，以检验抗生素筛选效果。
卫星菌落	有些生长较快的大肠杆菌菌株可能会快速降解抗生素，从而在转化株周围形成较小的非抗性菌落，称为卫星菌落。为避免过度生长，应将转化后的孵育时间控制在16小时以内。挑选周围无可见卫星细胞的良好隔离菌落用于筛选。
细胞密度过高	避免过多接种转化细胞，否则会导致培养基中的抗生素降解以及无载体的细胞过度生长。使用推荐的细胞体积并按需调整稀释度，从而减少和优化转化菌落的生产数量。
细菌转化步骤
耐抗生素的大肠杆菌菌株	检查大肠杆菌菌株的基因型。例如，INV110 可耐受四环素和链霉素。
质粒重组至染色体内	质粒序列可能被整合到细菌基因组中，从而使不含载体的细胞具有抗生素耐药性。为防止DNA重组和并实现载体的稳定繁殖，应使用具有 recA 突变的感受态细胞。

插入片段错误或截短

可能原因	建议
细菌转化步骤
插入片段不稳定	对于可能含有直接重复序列、逆转录病毒或慢病毒序列的不稳定DNA的克隆，应在转化步骤中使用特殊设计的感受态细胞，以防止质粒重组。
片段制备步骤
纯化提取条带错误	确保从良好分离的凝胶上切割正确的条带。使用合适的凝胶比例和电泳电压，从而对限制性酶切后可能存在的所有片段进行良好分离。应注意在电泳中可能会共迁移的条带。
限制性酶切步骤
酶切效果不理想	确保选定的限制性酶切位点对于目标序列是唯一的。检查载体图谱，使用载体序列比对载体位点，或根据需要对模板进行测序。克隆酶中存在的污染性核酸外切酶和核酸内切酶可能会截断目标片段。使用经测试确认不含这些污染物的高质量内切酶。应检查电泳中多余的条带和模糊条带，它们能够证明是否存在污染性核酸酶。为避免出现星号活性（即，酶切特异性改变）和不完全酶切，应遵守酶供应商建议的反应条件。

插入片段中的序列错误

可能原因	建议
细菌转化步骤
插入片段突变	质粒在转化细胞中增殖时，可能会发生突变。在筛选时，应挑选足量的菌落进行测序。如果所有菌落具有相同的插入片段突变，则突变可能来源于起始模板。对于可能含有直接重复序列、逆转录病毒或慢病毒序列的不稳定DNA的克隆，应在转化步骤中使用特殊设计的感受态细胞，以防止质粒重组。
片段制备步骤
紫外线损伤DNA	为了尽量减少紫外损伤，在从凝胶上切割DNA时应使用长波紫外线（360 nm）灯箱，并尽可能缩短曝光时间。如果使用短波（254–312 nm）灯箱，应将 DNA 的曝光时间限制在几秒内，并在透照期间将凝胶保持在玻璃或塑料板上。或者，使用具有更长激发波长（减少损伤）的染料使 DNA 显色。

更多疑难问题解决信息，请参阅我们的克隆支持中心或联系我们的技术支持团队。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。