限制性内切酶疑难解决指南

当使用电泳观察酶切结果时，您可能会观察到一些酶切问题，如：

您可在此了解引起这些问题的可能原因以及我们对于解决这些问题的建议。另请参见限制性内切酶关键注意事项

限制性酶切相关问题

不完全酶切或未酶切
可能原因建议
酶失活
  • 查看酶的过期日期
  • 确保酶的储存温度为 –20°C。低于该温度，酶可能会冻结，从而引起失活。
  • 避免反复冻融（不超过三次）。使用桌面冷冻盒存储和转移酶。 
  • 不要将酶储存于无霜冰箱或冷冻柜架上。
酶切方案欠佳
  • 遵循生产商对于限制性内切酶和底物 DNA 类型的推荐实验方案。
  • 确保所有添加剂或辅酶因子（如DTT、Mg2+、ATP、S—腺苷甲硫胺酸）添加至反应体系中。一些限制性内切酶需要添加这些添加剂或辅酶因子才能表现出活性（例如，Esp3I 需要 DTT）。
  • 使用推荐的和酶配套的反应缓冲液。对于双酶切，请遵循生产厂家对于缓冲液兼容性以及其它反应条件的建议。
  • 按照制造商指定的最优温度进行反应。如果使用需要不同酶切温度的酶来进行双酶切，则需要先完成低温酶切，再进行第二次更高温度的酶切。
  • 确保在孵育过程中，反应体积不会因蒸发而减少，从而导致盐浓度的升高，进而降低酶的活性。对于嗜热的酶来说，请使用带有加热盖的热循环仪。
内切酶稀释不当
  • 避免小体积(<0.5 µL)加样。可通过配制更大体积的工作储存液，从而保证加入每个反应的酶量准确。
  • 使用制造商推荐的稀释缓冲液配制工作储存液。
  • 不要在水或者 10X 反应缓冲液中稀释限制性内切酶。
反应体系配制不当
  • 最后一步向反应体系中加入限制性内切酶。加入酶后，轻弹或混合反应管，以确保酶没有由于甘油密度的原因沉降在管底部。
反应混合液中存在过多的甘油
  • 保持甘油在反应混合液中的浓度为<5%。加入反应体系的限制性内切酶体积应不超过总反应体积的 1/10，尤其是在进行双酶切的时候。
  • 确保反应体积不会因蒸发而减少，从而导致甘油浓度升高。
DNA 浓度不佳
  • 保持 DNA 在酶切混合液中的浓度在 20–100 ng/µL 最优范围内。
DNA 溶液污染
  • 通过硅胶离心柱纯化或通过苯酚：氯仿提取和乙醇沉淀去除残留的 SDS、EDTA、蛋白质、盐或核酸酶。用 70％ 的冰点乙醇洗涤 DNA 沉淀，以除去 EDTA 和盐。
  • 当酶切未纯化的 PCR 产物时，在酶切反应体系中， PCR 混合液的体积应不超过最终反应体积的 1/3（例如，在 30μL 总酶切反应体系中加入 10μL PCR 混合物）。
  • 如果使用硅胶或树脂悬浮液纯化 DNA，请以 ≥10,000 x g 的转速离心 10 分钟，以除去所有剩余的颗粒。将 DNA 溶液转移至新管时，避免带入树脂。
底物 DNA 中限制性内切酶识别位点丢失
  • 再次确认或重新测序 DNA 模板
  • 如果识别序列是由 PCR 引物引入的，则需要确认引物序列中包含有识别位点，并且在 5‘ 端添加了 4-8 个碱基。
  • 检查限制性内切酶是否针对一个靶点需要多个识别位点来实现其活性。通过添加含有识别序列或亚精胺的 DNA 寡核苷酸，可以提高这些需要至少两个酶切位点才能实现最佳酶切效果的限制性酶（例如 AarI，SfiI）的活性。
甲基化影响
  • 检查限制型内切酶的甲基化敏感性。如果限制性内切酶的活性被其识别位点的甲基化抑制，则应寻找一个不受甲基化影响的异裂酶或同裂酶（例如，用于 EcoRII 的 MvaI）。
  • 为避免 DNA 甲基化，请在 –/dcm–大肠杆菌宿主中增殖质粒。
  • 如果限制性内切酶需要识别序列甲基化才有活性（例如 DpnI 或 SgeI），则应在 dcm+/dam+大肠杆菌菌株中增殖质粒。或者，寻找该酶的异裂酶或同裂酶，其可酶切未甲基化的DNA（例如，用于 DpnI 的 MboI）。
底物 DNA 的结构
  • 对于酶切位点可能被隐藏的超螺旋质粒 DNA，应使用经过认证的内切酶来消化完整质粒。必要时，可添加较多量的限制性内切酶（例如，每微克 DNA 添加 5-10 单位）。
  • 对于酶切位点位于线性 DNA 末端的情况，请检查酶完全酶切所需额外添加的碱基。
  • 如果在载体的多克隆位点(MCS)内进行双酶切，请检查其与靶标序列的距离以及酶切位点之间所需的碱基数量，以实现酶的100％活性。第一种酶消化可能对第二种酶的活性产生不利影响。
  • 检查限制性内切酶是否对于一个靶点需要多个识别位点来实现其活性。通过添加含有识别序列或亚精胺的 DNA 寡核苷酸，可以提高这些需要至少两个酶切位点才能实现最佳酶切效果的限制性内切酶（例如 AarI，SfiI）的活性。
水中有杂质
  • 离心（10 分钟, 10,000 x g)约 1 mL 水，沉淀并检查可能存在的污染物。
  • 用水代替酶进行阴性对照反应，以确定水中是否存在核酸酶或细菌污染物。
  • 建议使用从可靠商业来源获得的新鲜且不含核酸酶的分子生物级纯水。

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意料之外的酶切图谱
可能原因建议
限制性内切酶的星号活性
  • 使用不超过推荐的酶量（例如每微克 DNA 添加 10 单位酶）。如有必要，减少反应物中的酶量。
  • 避免酶切反应孵育时间过长。
  • 使用推荐的反应缓冲液。盐浓度过低，pH 不理想，存在除 Mg2+ 以外的二价阳离子都可能会引起星号活性。
  • 确保反应物中的甘油含量不超过 5%。
  • 确保反应体积不会因蒸发而减少，从而导致甘油(>5%)和盐浓度升高。
其他酶引起的污染
  • 使用一管新的酶或缓冲液。由于处理不当，限制性内切酶或反应缓冲液可能被其他限制性内切酶污染。
其它底物 DNA 污染
  • 制备一份新的 DNA 样本。
DNA 迁移变慢（凝胶迁移）
  • 在电泳前，在含有 0.2％ SDS 的上样缓冲液中，将经酶切的DNA在 65℃ 下加热10 分钟。这一过程可将任何可能仍与底物 DNA 结合的酶解离下来，从而改善 DNA 的电泳迁移率。
底物 DNA 中存在意料之外的识别序列
  • 重新检查克隆策略和连接位点。DNA 结构中新产生的酶切位点可能被忽略。
  • 通过 Sanger 测序确认 DNA 序列的完整性。突变可能已经改变了模板上的酶切位点。重新增殖质粒，或用高保真 DNA 聚合酶扩增原始靶序列。
  • 甲基化可能影响限制性内切酶的切割（例如，MboI能被甲基化抑制，但DpnI却能被活化）。请参阅不完全酶切或无酶切中有关甲基化影响的建议。

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DNA 条带弥散

DNA 条带弥散

可能原因建议
DNA 质量差
  • 通过电泳检测未酶切的 DNA。如果在凝胶上观察到拖尾（降解）现象，则应重新纯化 DNA。
试剂污染
  • 重新制备试剂，使用新的酶，或根据需要对 DNA 再次进行纯化。反应组分可能在不恰当的操作中被核酸酶污染。
DNA 迁移变慢（凝胶迁移）
  • 在电泳前，在含有 0.2％ SDS 的上样缓冲液中，将经酶切的DNA在 65℃ 下加热10 分钟。这一过程可将任何可能仍与底物 DNA 结合的酶解离下来，从而改善 DNA 的电泳迁移率。

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如需更多疑难解决方法，请参阅我们的限制性内切酶克隆支持中心或联系我们的技术支持团队。