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细胞组分分离和细胞器分离概述
亚细胞组分分离和蛋白富集是蛋白质组学领域快速发展的的重要方法。亚细胞组分的分离和低丰度蛋白质的浓缩可以更有效地鉴别和研究目标蛋白。例如，分离完整膜蛋白或细胞核蛋白。
膜蛋白提取
膜蛋白大约占真核蛋白质组的 30%，是药物发现研究的关键目标。然而，由于其疏水性、碱性和大体积，因此很难被分离出来。
某些去垢剂可用于从细胞质（亲水性）蛋白中选择性地提取和分离膜（疏水性）蛋白。例如，Triton X-114 溶液在 0°C（形成澄清的胶束溶液）条件下是均匀的，但在20℃以上（浊点）会分离成水相和去污剂相，形成胶束聚集，溶液变浑浊。随着温度的升高，相分离会继续进行，直到形成两个透明相。蛋白质根据其亲水性和疏水性特征进行分离。膜蛋白富集在疏水部分。
Thermo Scientific Mem-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒 采用温和的去垢剂方案，通过选择性增溶从培养的哺乳动物细胞或组织中富集完整膜蛋白和膜相关蛋白。使用选择性去垢剂萃取可省去根据疏水性进行相分离的麻烦，从而实现更好的重现性和更高的通量。首先使用温和的去垢剂对细胞进行渗透处理，使可溶性细胞膜蛋白释放出来，然后再使用第二种去垢剂溶解膜蛋白。
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从不同组织中分离和富集膜蛋白。按照 MEM-PER Plus 膜蛋白提取试剂盒操作步骤，从冷冻的小鼠心脏或大脑 (30 mg) 中分离膜蛋白。膜蛋白和细胞质组分 (10 μg) 经 SDS-PAGE 分离后转移到硝酸纤维素膜上。使用 Thermo Scientific Pierce Fast Western Rabbit Dura 试剂盒 （货号 35071）和稀释为 1:1,000 的一抗进行蛋白免疫印迹。使用 Thermo Scientific myECL 成像仪生成图像。
继续阅读：功能性 G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 的提取与纯化
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核蛋白提取
制备优质的核蛋白提取物是许多基因调控研究成功的关键。使用细胞核提取物代替全细胞裂解液有几个原因。首先，基因调控领域的许多实验会受到全细胞裂解液中细胞成分的不利影响。其次，目标细胞核蛋白的浓度会被全细胞提取物中存在的大量细胞质蛋白稀释。最后，基因组 DNA 和 mRNA的存在使全细胞裂解液变得复杂。分离细胞核和制备核蛋白提取物有多种方法。然而这些方法大多耗时较长，需要机械均质化、反复冻融、大量离心或透析过程，这些步骤可能会破坏脆弱核蛋白的完整性。
Thermo Scientific NE-PER 细胞核与细胞质提取试剂盒 可在两小时内逐步裂解细胞，生成功能性细胞质和核蛋白组分。在处理培养的哺乳动物细胞或组织时，首先破坏细胞外膜以获得细胞质内容物，然后再提取细胞核中的蛋白。两种组分之间交叉污染极小 (<10%)。采用这种逐步分离流程，可以在不影响基因调控实验的情况下获得浓缩的细胞核提取物，这在分析全细胞裂解液时很常见。制备的提取物适用于多种下游应用，包括使用细胞核提取物的电泳迁移实验 (EMSA) 、使用细胞质提取物的报告基因测定、Western 印迹、酶测定和 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白测定。
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四种不同 DNA-蛋白复合物的化学发光 EMSA。使用 20 fmol 生物素标记的 DNA 双链（每链 1 种生物素）和 2 µL （6.8 µg 蛋白总量）从 HeLa 细胞制备的 NE-PER 核提取物进行 DNA 结合反应。对于含有特异性竞争 DNA 的反应，使用摩尔过量 200 倍的未标记特异性双链。
亚细胞蛋白组分分离
Thermo Scientific 亚细胞蛋白组分分离试剂盒 可从哺乳动物培养细胞或组织中逐步分离并提取细胞质蛋白、膜蛋白、可溶性细胞核蛋白、染色质结合蛋白和细胞骨架蛋白。使用亚细胞蛋白组分分离试剂盒获得的蛋白质可与多种下游应用兼容，包括 Western 免疫印迹、蛋白测定、电泳迁移测定以及报告基因和酶活性检测。
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使用市售试剂盒进行亚细胞组分分离的示意图。在每个步骤中，上清液包含相应的亚细胞组分，沉淀可用于后续步骤。加入培养细胞沉淀的第一种试剂是缓冲液 A，它可使细胞膜选择性通透，从而释放出可溶性细胞质内容物。第二种试剂，即缓冲液B，可溶解血浆、线粒体和内质网-高尔基体膜，但不溶解核膜。然后通过离心回收完整的细胞核，并使用缓冲液 C进行第三次细胞核提取，就得到了可溶性核提取物。如果要提取染色质结合的细胞核蛋白，可以在缓冲液 C中加入微球菌核酸酶 (MNase) 作为额外步骤。然后使用沉淀提取缓冲液 D 提取回收的不溶性沉淀物，从而分离出细胞骨架蛋白。
通过亚细胞蛋白组分分离可从特定细胞区室进行蛋白定位评估和蛋白富集。亚细胞蛋白组分分离试剂盒含各种试剂，可按步骤在三小时内将细胞裂解为功能性细胞质、细胞膜、可溶性细胞核、染色质结合和细胞骨架蛋白。从每个亚细胞区室获得的提取物各组分之间的污染度一般低于 15%，这对于大多数研究蛋白定位和再分布的实验来说，纯度已经足够。
继续阅读：可提高蛋白质组覆盖率的亚细胞蛋白组分分离方法
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线粒体分离和线粒体蛋白分离
完整线粒体的分离通常是一个费力的过程，需要用杜恩斯均质化处理单个样本。密度梯度离心方法也是有效的，但一般只适用于大规模需求。当目标是小规模富集线粒体和/或提取线粒体蛋白时，最好采用基于试剂的微量离心法。
Thermo Scientific 线粒体分离试剂盒 采用非机械、基于试剂的方法，可同时处理多个样品（多达 6 个）。使用专属配方对培养的哺乳动物细胞颗粒进行温和裂解，从而在最大程度地提高线粒体产量的同时，最大限度地减少对完整性的破坏。提供了优化纯度及产量参数的指南。此外还包括杜恩斯均质化流程的说明，与基于试剂的方法相比，该方法可以使线粒体的回收率提高两倍。两种方法都使用台式微量离心机以不同离心速度分离线粒体和细胞质部分，分离过程大约 40 分钟（细胞收获后）。线粒体分离后可用于下游应用，如细胞凋亡、信号转导和代谢研究，也可用于线粒体蛋白质组学研究。
继续阅读：分离功能性突触体的方法
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。