免疫共沉淀 (Co-IP)

在介绍免疫共沉淀主题之前，最好概述免疫沉淀法 (IP)，以辅助勾勒对所涉原理的理解。在此简单说明 IP 方法论。

免疫沉淀是最广泛用于检测和纯化抗原的方法之一。IP 的原理非常简单：针对特定靶蛋白的抗体（单克隆或多克隆）与样品中（如细胞裂解液）中该靶蛋白形成免疫复合物。然后在加珠的支持物上捕获或沉淀免疫复合物（抗体结合蛋白（如蛋白 A 或 G）固定到该支持物上），并且洗去未沉淀在珠上的蛋白质。最后，将抗原（和抗体，如果该抗体未共价连接至珠和/或用变性缓冲液时）从支持物洗脱，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，往往继而进行蛋白质免疫印迹检测以验证抗原的身份。

标准免疫沉淀测定法示意性总结

免疫共沉淀是 IP 的扩展，它基于 IP 反应捕获并且纯化样品溶液中一级靶标（如，抗原）以及通过天然相互作用与该靶结合的其它大分子。因此，一项实验是否称为 IP 或 co-IP 取决于该实验的焦点是一级靶蛋白（抗原）还是二级靶蛋白（相互作用蛋白）。

标准免疫共沉淀测定法示意性总结

虽然 co-IP 方法简单，但可能难以进行 co-IP 反应及鉴定生理性蛋白质-蛋白质相互作用，原因是相互作用的性质、非特异性结合于 IP 组分和可能掩蔽检测的抗体污染。以下部分描述了 co-IP 方法中可以优化以改进检测效果的每个方面。

由于免疫共沉淀如此依赖于蛋白质-蛋白质相互作用以检测结合的蛋白质，故能够遍历孵育步骤和洗涤步骤的机械应力和化学应力，维持稳定的生理相互作用是进行 co-IP 反应时的关键因素。因此，低亲和力或瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用可能用 co-IP 检不出，除非可以稳定这种相互作用。

贯穿 co-IP 所要求的步骤维持复合物形成的关键因素是裂解缓冲液和洗涤缓冲液。如 Pierce 蛋白方法文库的 免疫沉淀 法中所述，使用标准非变性裂解缓冲液后，许多蛋白相互作用仍将保持完好。含有非离子型表面活性剂（NP-40 和 Triton X-100）的低离子强度缓冲液（如，<<120 mM NaCl）不太可能破坏蛋白质-蛋白质相互作用；然而，可能需要经验性测试以确定针对特定的目标蛋白质复合物的最好缓冲液配方。

此外，应当避免洗涤步骤期间通过超声作用裂解细胞或涡旋混合裂解物或珠结合的免疫复合物，以防止破坏靶标复合物的蛋白质-蛋白质相互作用。虽然离心是从剩余的裂解物中及在洗涤步骤期间分离已沉淀复合物的标准方法，但仍应柔和处理样品，以防止结合的蛋白复合物损失。

通过交联结合配偶体以加强蛋白质-蛋白质相互作用是一种更高级的技术。使用这种方法，细胞裂解物中特定试剂的活性距离以内的所有蛋白都共价交联，而随后可以将靶蛋白连同复合物中的其它蛋白一起免疫沉淀，而没有丢失结合配偶体的风险。

琼脂糖珠长期以来作为免疫沉淀和其他基于亲和的纯化方法的常用支持物，而 磁珠正在 IP/Co-IP 和其他的小规模亲和方法中替代琼脂糖珠。尽管琼脂糖珠通常因其多孔表面而具有更高结合容量，但磁珠提供诸如易用、非特异性结合较低以及兼容于自动化等优势。

细胞裂解物中有无数种蛋白质，不可避免的是将发生与 IP 抗体非特异性结合，尤其使用靶蛋白免疫沉淀 分批法 （一种温和、大规模方法）时如此。此外，因为正常情况下被分离入独立细胞区室的诸蛋白质现在混在一起，可能发生与靶复合物的非生理性结合，尤其与富量的蛋白质如肌动蛋白结合。往往可以通过彻底洗涤珠结合的免疫复合物打破这些非特异性相互作用，但其他策略可以用于优化非特异性结合，这些策略包括：

• 通过滴定 120 至 1000 mM 的盐浓度改变 IP 缓冲液的离子强度。
• 减少一级抗体的量直至信噪比最大化。
• 如 免疫沉淀 部分中所述，预清洁裂解物。

随 IP 法和 co-IP 法最常遇到的问题之一是凝胶分析期间来自抗体条带的干扰。在这些情况中，几种蛋白可与靶标蛋白一起共沉淀的情况下，样品中存在共洗脱的的抗体轻链和重链（还原性 SDS-PAGE 凝胶中分别是 25 kDa 和 50 kDa 条带）可能让结果模糊。理想情况是在抗体不污染已洗脱抗原下进行 co-IP 分析；并且，随着消除这个潜在干扰，仅共沉淀的蛋白质才将在凝胶上呈现并检出。

抗体污染可以使用在免疫沉淀方法概览页面中所述的方法规避，这些方法包括将抗体交联至蛋白 A/G 包被的珠或将抗体直接共价结合至处理的珠上。这些方法的一个额外好处是可能重复使用抗体包被的珠。使用这些策略防止抗体污染的一个关键是要在非变性条件下洗脱抗原；否则，变性的抗体片段将随抗原一起洗脱。

活性 Rac1 与加 HA 标签的 Pak1-PBD（p21 结合域）发生 Co-IP。将人 293 细胞用单独或随组成型激活的 Rac1 (Q61L) 共转染的 HA-Pak1 蛋白质结合域 (PBD) 转染。然后，将抗 HA 琼脂浆液 (6 µL) 与 50μL 加 HA 标签的阳性对照裂解物（泳道 1）或 500 μL 来自 Rac1 (Q61L) 和 HA-Pak-PBD共转染的细胞中的细胞裂解物（泳道 2）孵育。HA-Pak1-PBD 转染的细胞 （泳道 3）或未转染的细胞（泳道 4）。IP 反应和 co-IP 反应在 4℃过夜进行。蛋白质免疫印迹物首先用抗 Rac1 抗体 (A) 探测，然后用抗 HA 抗体 (B) 再探测。

当检测蛋白质-蛋白质相互作用时，与因实验方法中某方所致的人为相互作用相反，确认该检测是真实的生理性相互作用至关重要，。验证蛋白质-蛋白质相互作用的方法总结如下。

抗体的质量和特异性涵盖那些微弱结合和无特异性者到那些对单个表位显示出高亲和力和特异性者。取人任何已检出蛋白质-蛋白质相互作用的一个重要部分是首先确认，可以从样品中共沉淀靶蛋白，这使用充分表征的已知特异性结合靶抗原的抗体来确认。如果不可获得抗体的特异性数据，则缺少该靶蛋白的细胞应当配合 IP 抗体一起用来证明：使用该抗体时，未沉淀任何东西。当然，当测试未表征的抗体时，应始终纳入一个对照，以证明使用供试抗体时，可以从已纯化蛋白质的原液中沉淀靶蛋白。

而多种抗体验证策略 可以用于验证抗体的特异性，通过免疫沉淀法继而质谱分析 (IP-MS) 验证抗体也可辨识先前已知的蛋白质-蛋白质相互作用，以及提出先前尚未描述的潜在相互作用配偶体。

如果 co-IP 检出的结合配偶体真实地与特定靶蛋白相互作用，则多种针对同一表位特异的一级抗体应当产生相同的结果。结合相同靶蛋白、但表位特异性有差异的抗体也可以免疫共沉淀相同的蛋白质，不过已知抗体阻止或破坏蛋白复合物的蛋白质-蛋白质相互作用。与人为假象相反，真实蛋白质-蛋白质相互作用的另一个指标是：使用针对结合配偶体的 IP 抗体时可以免疫共沉淀两种蛋白质之一（如，蛋白质 A 可用于免疫共沉淀蛋白质 B，而蛋白质 B 可用于免疫共沉淀蛋白质 A）。

甚至高品质单克隆抗体可能与非特异性蛋白结合；因此，使用非靶抗体（通常也称为“无关抗体”）进行 co-IP 对确认以下情况至关重要：免疫沉淀的蛋白质复合物是需求的特定复合物。并且因为抗体特异性依据亚类而异，故建议使用尽可能密切匹配一级抗体的对照抗体。

许多蛋白质-蛋白质相互作用依赖于激活复合物中的一种或多种结合配偶体。因此，为了检验是否发生真实的相互作用，表达这些结合配偶体之一的无活性变体的细胞可以用于蛋白质复合物的 co-IP；如果要求激活，则该复合物将不随靶抗原一起共沉淀。

细胞裂解引起从不相互作用的诸蛋白质形成紧密缔合，并且不可避免一些蛋白质将彼此结合。为了检验细胞裂解后检出的蛋白质复合物是否形成，Ohh 等人代谢标记了细胞中的所有蛋白质，然后用含有纯化、未标记形式的目的蛋白的裂解缓冲液裂解细胞。因为这个未标记的蛋白质不能与放射性标记的蛋白质竞争借助 co-IP 恢复的复合物形成，故研究者得出结论，复合物再现了裂解之前形成的有生理意义的相互作用。

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