WB蛋白印迹膜再生-抗体剥离-赛默飞 | Thermo Fisher Scientific

蛋白质印迹法的剥离和再检测是一种从蛋白质印迹上去除一抗和二抗的检测方法，以便对印迹进行再检测。印迹可进行多次剥离和再检测，以显示其他蛋白质或优化蛋白质检测（即抗体浓度），而无需使用多个凝胶和转移。

本页内容

为什么要剥离和重新检测印迹？
重新检测印迹的优点
如何剥离和重新检测蛋白印迹膜
测试和重新检测剥离的印迹

为什么要剥离和重新检测印迹膜？

信噪比 (S/N 比率) 是指某事物中相关内容 (信号) 与不相关内容 (噪声) 的比率。在蛋白质印迹法中，信号是指被检测的特定蛋白带的密度；噪声是指背景的密度。优化信噪比通常比提高系统的灵敏度更重要。如果无法区分信号和噪声，系统的灵敏度就毫无意义。在需要时，蛋白质印迹法的优化过程非常耗时，而且会耗尽宝贵的样品。重新检测蛋白质印迹法可以节省时间，保护样品，同时可以根据需要进行优化。重新检测蛋白质印迹法可以节省时间，保护样品，同时可以根据需要进行优化。重新检测还可以对同一印迹进行不同目标蛋白的检测。

重新检测印迹的优点

研究人员选择剥离和重新检测蛋白质印迹的原因主要有几个。以下是最重要的考虑：

节省珍贵样品	当蛋白样品非常稀有或珍贵时，重复检测可以节约样品，并实现使用相同或不同的抗体分析同一张膜。
节省时间	运行SDS-聚丙烯酰胺凝胶并将蛋白质转移到膜上非常耗时。通过将同一块印迹用于多次不同的检测，可以节省时间。
节省成本	通过重复使用同一块印迹，可以节省凝胶、膜和蛋白质样品的成本。
更轻松地优化检测	高灵敏度化学发光底物的发光强度通常需要优化抗体浓度，以获得高质量的印迹结果。通过剥离膜并使用不同浓度的抗体重新检测，可以轻松进行优化。
快速确认异常结果	当免疫印迹结果不符合预期时，重新检测可以使用相同的蛋白质样本，而无需重新进行凝胶电泳。
纠正错误	免疫印迹法需要经过许多步骤，因此很容易出错。通过剥离膜，印迹可以重复使用。

使用 Restore Plus Western Blot 抗体剥离液剥离 Western 印迹膜以使用不同抗体进行再检测的示例

蛋白质印迹剥离示例。使用肌动蛋白抗体检测 HeLa 肿瘤细胞裂解物，并用 Thermo Scientific Pierce ECL 底物进行检测。然后用 Thermo Scientific Restore PLUS 加强型抗体剥离液剥离印迹。然后重新封闭印迹，用环素蛋白 B 抗体重新检测，并用 Pierce ECL 底物检测。

如何剥离和重新检测蛋白质印迹膜

剥离膜的关键是使用让抗体与抗原充分分离的条件，但不能让大量抗原（蛋白质）从膜上剥离。为了达到这一目的，人们开发出了各种方案，通常包括漂洗剂、还原剂、加热和/或低 pH 值等组合。在剥离过程中，一定量的抗原会不可避免地从膜上剥离。重要的是，在温和条件下剥离抗体，以尽量减少目标蛋白的损失。由于每个抗体-抗原对都有其独特的特性，因此没有一种方法可以保证在去除所有抗体的同时保留抗原。

在开始剥离膜以重新检测之前，需要考虑以下事项：

使用 PVDF 膜	PVDF 膜的蛋白质结合能力为 170–200 µg/cm²，由于疏水性更强，因此比其他载体能更好地吸附蛋白质。聚偏氟乙烯（PVDF）比硝化纤维素更不易碎裂，因此在需要多次重复处理（剥离和再探针程序）时更耐用。
膜再生适用于化学发光和荧光蛋白质印迹法	比色/显色检测试剂会在膜上留下永久可见的污渍，无法通过剥离方法去除。
从温和条件开始	从温和条件开始，以避免样品损失。如果需要分离强抗原抗体对时，再使用更剧烈的条件。
首先检测低丰度蛋白	每轮剥离都会有抗原丢失。通过首先检测低丰度蛋白或低亲和力抗体，可最大程度地降低这些影响。
避免使用抗生物素蛋白偶联物	链霉亲和素与生物素之间的连接非常强烈，很难解离以进行重新检测。

蛋白质印迹膜的温和剥离

温和型抗体剥离液配方

甘氨酸	15 g
SDS	1 g
Tween 20	10 mL
去离子水	800 mL
用盐酸将 pH 值调至 2.2
去离子水	至 1000 mL

即用型方案：Restore抗体剥离液或Restore荧光抗体剥离液

温和抗体剥离方案（低pH值剥离）

用水冲洗膜，去除膜上多余的化学发光底物。

室温下，将膜蛋白面朝上置于抗体剥离液中，并轻轻搅拌，孵育 10-20 分钟。确保抗体剥离液的量足以完全覆盖膜。

优化孵育时间和温度对于获得最佳结果至关重要。对于某些抗体，室温孵育就足够了。然而，高亲和力抗体或饱和印迹（过量的二抗）可能需要在 37°C 下再孵育 5 至 10 分钟。

用漂洗液（TBST 或 PBST）洗膜 3 次，每次 5 分钟。

建议：在重新检测前，对膜进行再封闭。

蛋白质印迹膜的强效抗体剥离

强效型抗体剥离液配方

0.5 M Tris HCl, pH 6.8	12.5 mL
10% SDS	20 mL
2-巯基乙醇	0.8 mL
去离子水	67.5 mL
在使用前在通风橱中配置缓冲液

即用型方案：Restore PLUS 加强型抗体剥离液

强效剥离方案（通过加热和去垢剂进行膜再生）

用水冲洗膜，去除膜上多余的化学发光底物。
将膜的蛋白质面朝上放在抗体剥离液中，在通风橱中轻轻搅拌，在 50°C 下孵育 30 分钟。确保剥离缓冲液的量足以完全覆盖膜。
用漂洗液（TBST）洗膜 6 次，每次 5 分钟。
在重新检测前，对膜进行再次封闭。

测试和重新检测剥离的印迹

在剥离后，应对印迹进行测试，以确保所有检测试剂都已去除。膜应进行多次漂清洗、封闭、与二抗孵育，然后与化学发光底物重新孵育。如果通过剥离程序有效去除了一抗，则二抗不应与膜结合，也不应产生信号。如果印迹上仍然可见条带，则必须加强剥离条件。通常，简单地延长反应时间或提高温度即可完成剥离过程。然而，有时需要改变抗体剥离液的成分或完全改变方法。

用几种不同的商品化抗体剥离液对蛋白质印迹进行剥离后化学发光信号的比较，以了解一抗和二抗是否在重新印迹前被去除。

使用不同商品化抗体剥离液对蛋白质印迹上的一抗和二抗的剥离效果进行比较。数据为化学发光信号的密度测定分析。

蛋白质印迹的抗体剥离和再检测。 硝酸纤维素上抗体剥离效果的比较。通过 SDS-PAGE 分离三种不同浓度的 HeLa 细胞裂解物，并转移到 0.45 μm 硝酸纤维素膜上。(A) 封闭后，使用 SuperSignal West Dura 底物通过蛋白质印迹法分析膜。用抗 Hsp90 多克隆抗体检测膜，然后用山羊抗兔辣根过氧化物酶结合物进行成像。在初步检测后，根据制造商的说明，将印迹切片分成三部分，分别用Restore 抗体剥离液、Reblot Plus 抗体剥离液或 Revitablot 蛋白质印迹剥离液进行剥离。剥离后，将膜切片清洗、与底物孵育并成像。膜切片重新封闭，并重复上述蛋白质印迹法步骤。（B）密度测定分析表明，Restore 抗体剥离液能够完全去除信号，并且在初始和重复蛋白质印迹分析之间保持几乎相同的检测水平。