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细菌无细胞蛋白表达
膜蛋白在细胞间联系、表面识别、细胞骨架接触、信号传导、酶活性及物质运输中扮演了重要角色。由于其具有多种细胞功能，膜蛋白是非常理想的药物靶标。但是，膜蛋白的进一步应用具有很大挑战，因为它们的表达可能导致细胞毒性或内含体的形成，这种形成会限制蛋白得率，另外其复杂的优化过程使得纯化非常困难并且耗费时间。
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MembraneMax™ 蛋白表达系统
MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒克服了多项挑战，使你可以使用MembraneMax™试剂来获得高得率的可溶（分散）膜蛋白——这种试剂是由支架蛋白包裹的磷脂双分子层组成的（也被称为微脂蛋白颗粒或NLP）。
主要优势
- 高得率——纳克至毫克级
- 增强蛋白可溶性——制得的蛋白形成了NLP复合物
- 容易纯化——His亲和标签
- 完整试剂盒——只需加入你感兴趣的基因然后开始实验即可
高得率有助于你的下游分析
膜蛋白的表达通常是很困难的，因为其在细菌系统中是不可溶的，有着体内毒性，或者只是在哺乳动物系统中得率较低。我们的Ultimate™ ORF产品系列可用来获得膜蛋白，我们已经测试了不同大小(8 kDa至51k Da)和复杂程度(2至7个跨膜域)的膜蛋白。在添加了MembraneMax™试剂后，大部分蛋白表达水平可达>0.1mg/mL（参见表格），这种表达水平几乎可满足所有种类的下游应用需求，包括抗体制备、蛋白结晶、免疫沉淀、配体结合或功能性分析、质谱、NMR及蛋白芯片构建等。
| 膜蛋白 (GenBank 登记号) | 得率(mg/mL) | 膜蛋白 (GenBank 登记号) | 得率 (mg/mL) |
|---|---|---|---|
| Glycophorin (NM_002102.2) | 0.41 | Bacteriorhodopsin (J02755.1) | 0.33 |
| CRHR1 (NM_004382) | 0.30 | MGST2 (NM_002413.3) | 0.30 |
| Glycophorin E (NM_002102.2) | 0.30 | MGST2 (NM_004528.2) | 0.30 |
| Epiregulin (NM_001432.1) | 0.30 | b2 adrenergic receptor (NM_000024.3) | 0.30 |
| CKLF (NM_81640.1) | 0.30 | UNQ1887 (BC025781.1) | 0.30 |
| SPPL2B (BC001788.1) | 0.30 | CHRM1 (NM_000738.2) | 0.27 |
| PPAPDC1B (NM_032483.2) | 0.20 | CHRM2 (NM_000739.2) | 0.30 |
| 上述表格显示了我们使用MembraneMax™蛋白表达试剂盒所表达的一部分蛋白质。超过64%的蛋白质其表达水平可达单次反应>0.1 mg/mL (n=32)。 | |||
增强的蛋白可溶性
蛋白表达中最普遍的问题之一是重组蛋白的不可溶，常常形成内含体。这一问题在使用膜蛋白时尤其严重，因为其同时有着亲水域和疏水域，还具有复杂的折叠模式。 MembraneMax™蛋白表达试剂盒使用了全新的MembraneMax™试剂来增强大小和复杂度范围内的过表达膜蛋白的可溶性。
规模可变且易用
只需将编码你所需膜蛋白的T7大肠杆菌表达载体与Expressway™无细胞大肠柑橘提取物和MembraneMax™试剂混合，孵育2小时然后进行纯化即可。在一天之内，你就可以得到数毫克的可溶性膜蛋白以进行下游分析，而无需使用去垢剂或冗长的重构方案。MembraneMax™蛋白表达试剂盒含有所有成功表达膜蛋白所需的试剂；其无细胞规格可对多个样品进行高通量表达筛选，或对单一膜蛋白进行大规模制备。
简单的纯化方法
纯化时常遇到的挑战显著地阻碍了膜蛋白的研究，例如在维持蛋白稳定性和功能的同时，还需要花费大量时间对不同去垢剂和提取条件进行测试以去除其他内源性膜蛋白。与此不同的是，MembraneMax™ HN 试剂盒中含有His标记的MembraneMax™试剂，可无需向膜蛋白添加任何标记即可进行纯化。你也可以灵活地设计在膜蛋白N端或C端含有你偏好的纯化标签的DNA模板，从而可在使用MembraneMax™ HN 组件时纯化得到非常纯净的膜蛋白-NLP复合物。无论你希望使用天然膜蛋白还是标签标记膜蛋白，我们的MembraneMax™试剂盒均可满足你的灵活性需求。
Expressway™ 表达系统
Expressway™ Mini 及 Maxi无细胞表达系统
The Expressway™ 无细胞大肠杆菌表达系统专门设计用于单次反应中将目标DNA体外转录及翻译为蛋白质的实验。这种灵活的系统可在不到3小时内从表达构建制备得到感兴趣的重组蛋白。纯化之后，获得的重组蛋白可用于其他下游应用，包括生物化学、物理学、结构学特性分析等。该系统有两种规格：Expressway™ Maxi9(可用于20-100次反应体系)及Expressway™ Mini（可用于20次反应体系）。
The Expressway™ 无细胞大肠杆菌表达系统带来了一种制备高水平重组蛋白的方法，可轻松进行检测和纯化。该系统提供了：
- 高得率——通过使用独特配方的Feed Buffer在4-6小时内即可完成毫克级蛋白制备
- 高通量能力——反应可在96孔板中进行，当检测到阳性表达后，即可进行扩大培养
- 优化的TOPO TA载体——设计以最小化可能影响天然蛋白质折叠和功能的额外氨基酸序列
- 可制备具有细胞毒性的蛋白质
Expressway™ Lumio™ 表达及检测系统
Expressway™ Lumio™ 表达及检测系统利用了Lumio™识别序列的优点，该序列是一段很短的六氨基酸序列（Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys）。Lumio™检测试剂可高特异性及高亲和性结合至识别序列上，从而产生明亮的荧光信号，可用于实时蛋白制备分析和蛋白质凝胶直接检测。另外，Expressway所用的特化的E. coli裂解物是得自slyD突变菌株的，可消除Lumio™绿色检测试剂与内源性SlyD蛋白的非特异性结合，从而可优化重组蛋白检测的背景。Lumio™绿色检测试剂盒包含在实时蛋白分析和凝胶蛋白检测的系统中。
细菌无细胞表达载体
查看与Expressway™无细胞表达系统及MembraneMax™蛋白表达试剂盒兼容的载体。
| 载体 | 克隆系统 | 融合标签 | 推荐的 无细胞表达系统 |
|---|---|---|---|
| pEXP1-DEST | Gateway | N端Xpress™，6xHis | E, M |
| pEXP2-DEST | Gateway | C端V5，6xHis | E |
| pEXP3-DEST | Gateway | N端6xHis，Lumio™ | E, M |
| pEXP4-DEST | Gateway | C端6xHis，Lumio™ | E, M |
| pEXP5-NT/TOPO | TOPO | N端6xHis | E, M |
| pEXP5-CT/TOPO | TOPO | C端6xHis | E, M |
| E= Expressway™ 无细胞表达系统。M = MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒 | |||
融合标记蛋白抗体
根据所用无细胞蛋白表达系统和载体选择所表达蛋白对应抗体。
| 用于 | 产品 | 表位 |
|---|---|---|
| pEXP1-DEST | Anti-Xpress™ 抗体 | 检测8氨基酸 Xpress™ 表位 DLYDDDDK |
| pEXP1-DEST, pEXP3-DEST, pEXP5-NT/TOPO | 抗HisG抗体, 抗HisG-HRP抗体, 抗HisG-AP抗体 | 检测N端多组氨酸（6xHis）后接甘氨酸标签：HHHHHHG |
| pEXP2-DEST, pEXP4-DEST, pEXP5-CT/TOPO | 抗His （C端）抗体, 抗His （C端）-HRP 抗体, 抗His （C端）-AP抗体 | 检测C端多组氨酸（6xHis）标签：HHHHHH-COOH（检测需要自由羧基） (Linder et al., 1997) |
| pEXP1-DEST, pEXP2-DEST, pEXP3-DEST, pEXP4-DEST, pEXP5-NT/TOPO, pEXP5-CT/TOPO | Penta-His小鼠IgG1 单克隆抗体 | 检测N端及C端多组氨酸(6xHis)标签 |
| pEXP2-DEST | 抗V5 抗体, 抗V5-HRP抗体, 抗V5-AP抗体 | 检测得自副粘病毒P及V蛋白的14氨基酸表位：(Southern et al., 1991) |
Ni-NTA和cobalt IMAC纯化树脂
查找用于多组氨酸标签蛋白纯化的固相金属亲和色谱(IMAC)填料。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。