向细胞中输送RNAi - 转染与病毒输送

RNAi输送的两种常规方式为脂质介导的转染与病毒介导的转导。用户需要基于所研究的细胞类型、以及瞬时或稳定敲低的相关需求（表1和表2）来决定具体使用哪一种手段。最为流行的应用——瞬时转染未经修饰的siRNA或修饰过的Stealth RNAiTM RNA双链——一般使用阳离子脂质试剂来实施，因为这类试剂很适合在多样的常用细胞株之间输送分子。对于不易使用脂质体转染的细胞类型，人们通常采用病毒载体。腺病毒载体适用于多种细胞类型的瞬时转染；不过，对于像不分裂细胞等难转细胞系或稳定的RNAi表达应用而言，慢病毒载体是更佳的输送方法。另一个确定RNAi更佳输送条件的方法是使用Invitrogen的输送优化服务（delivery optimization service）——一个在病毒载体及非病毒输送试剂应用方面拥有广泛的专业知识和技术的科学资源，其中涵盖了大量输送参数的测试数据。

表1.推荐的RNAi输送方法

表2.选择转染试剂和病毒输送方法

实现高转染效率的方法

转染效率描述了成功接收RNAi双链或表达质粒的细胞百分比。一般情况下，研究人员都渴望获得尽可能高的转染效率。这一目标对于RNAi应用至关重要，因为未转染细胞会持续表达敲低的靶基因，从而增加表达本底。

对于许多疾病模型而言，原代培养细胞是人们最期望进行操作的细胞类型。不过，使用市面上的商品化转染试剂，往往不能使这些细胞获得充分的转染效果。阳离子脂质体转染的一个强力替代技术是病毒输送，该技术使用病毒载体来表达RNAi序列。这对难于转染的原代细胞和非分裂细胞而言是最好的替代选择。病毒输送技术也可用于建立可诱导RNAi表达的稳转细胞系，或以组织特异性启动子驱动RNAi序列的的稳转细胞系。

降低转染所介导细胞毒性的重要性

输送RNAi的试剂或转染技术本身，都可能在基因沉默实验中导致细胞毒性。使转染介导的细胞毒性最小化，对于RNAi实验结果的正确解释是必需的，因为细胞毒性本身即可能产生与靶基因敲低类似的表型。如果细胞在转染了与靶基因相类似GC含量的阴性对照时，仍产生了明显的敲低效果，则可假设转染技术导致了细胞毒性。克服输送技术所导致细胞毒性的最简单办法，是选择专为双链RNA或基于质粒的RNAi转染技术而设计的转染试剂。在大多数情况下，这些试剂的配方都力图在实现最大转染效率（达到最高的敲低水平）的同时，使细胞毒性最小化。以供应商所提供的或已发表的实验方案作为指导，对实验条件进行优化，可以帮助用户确定针对靶细胞系的更佳试剂使用浓度。我们建议在实现最高水平敲低效率的必要条件下，使用最低剂量的转染试剂 。

降低脱靶效应的重要性

未经优化或超量的输送试剂在成为细胞毒性来源的同时，还可能导致明显的脱靶效应。脱靶效应的一个原因即为细胞输送操作所导致的基因上调或下调作用。不过，在设置了适当对照的条件下，这些效应可以得到鉴定和避免。同样的，我们推荐在能够提供更佳基因沉默活性的条件下使用最低剂量的转染试剂。
潜在的脱靶效应可能由siRNA双链自身的敲低效应所导致。用户可将转染试剂的浓度维持在之前所鉴定的最低浓度不变，在此基础上改变siRNA的浓度，来确定更佳的应用条件。此时应该使用能够在RNAi实验中达到理想敲低水平的最低siRNA浓度。请记得siRNA的特异性将影响潜在的脱靶效应水平。使用修饰过的Stealth RNAiTM siRNA双链等一类极特殊的试剂，可能会对减少此类问题有所帮助。