• 优化试剂和方案以最小化内源 Rnase 活性
  • 极适用于鉴定组织中和荧光染色的靶细胞
  • 设计用于冷冻，OCT 嵌入式组织切片（6-10µm）
  • 与 Arcturus LCM 系统兼容
  • 与 Ambion’s RNAqueous-Micro RNA 分离试剂盒和 MessageAmp™II aRNA 扩增试剂盒配合使用，实现卓越的基因表达分析

用于 RNA 分析的 LCM

激光捕获显微切割（概述参见激光捕获显微切割（LCM）：如何完成，右图）是一种允许科学家从组织切片中选择性收集纯细胞群的方法。对于 RNA 研究，冷冻的 OCT 包埋组织通常优于福尔马林固定，石蜡包埋的组织 - 福尔马林固定引入核酸和蛋白质之间的交联，导致 RNA 片段化。然而，当组织切片暴露于水溶液时，通过内源 RNA 酶的再活化使得从冷冻组织中提取 RNA 也变得复杂，如常规染色方案的情况。

为了解决从 LCM 样品中获得高质量 RNA 的技术问题，Ambion 科学家开发了用于冷冻 OCT 包埋组织的 LCM 染色试剂盒。LCM 染色试剂盒使研究人员能够从小而均匀的样品中获得高质量的总 RNA，特别是与 Ambion 的 RNAqueous-Micro RNA 分离试剂盒结合使用时，该试剂盒现在包含用于 LCM 样品的其他试剂和方案。

卓越的染色，以识别目的细胞

LCM 染色试剂盒包含两种染色剂，与传统方案相比，可产生更好的效果。这些染色极大地促进了 LCM 期间靶细胞的识别（图1）。只有 Ambion 的染色程序才能避免将组织切片暴露于重新激活内源性 Rnase 活性的水溶液中。


图 1.使用 Ambion 的 LCM 染色试剂盒染料获得更好的分辨率。根据制造商的说明对来自人小肠的连续切片（放大20倍）进行染色。

甲酚紫（基本核染色）

甲酚紫是一种基本的合成染料，可以结合酸性成分，如富含 RNA 的核糖体、细胞核和核仁。这种组织学染色已被用于染色神经组织，特别适用于允许研究人员识别细胞形态和组织结构（见图2）。


图 2.在 Ambion 的 LCM 染色试剂盒中用甲酚紫染色 LCM 样品。这些代表性照片显示来自人卵巢的8µm切片（放大20倍），其用甲酚紫染色并用 Pixel IIe LCM 系统（Arcturus）切割。卵巢腺癌细胞的 LCM 样品簇。

吖啶橙（荧光嵌入染色）

吖啶橙染料嵌入核酸中以增强细胞簇中细胞核的可见性（图3）。富含核的上皮组织，例如恶性细胞簇，很容易用这种染料鉴定。用吖啶橙染色的分离细胞在显微切割后将在帽上发荧光，使得易于评估细胞是否被有效地显微切割和回收。如果组织形态受到轻微损伤，吖啶橙也可提供比甲酚紫更好的对比度。


图 3.在Ambion的LCM染色试剂盒中用吖啶橙染色LCM样品。这些代表性照片显示来自小鼠海马的10μm切片（放大4倍），其用吖啶橙染色，随后用Pixel IIe LCM系统（Arcturus）切割。LCM样品海马颗粒细胞层和齿状回。

用于下游应用的优质RNA

用Ambion独特的染料配方染色样品后分离的RNA的完整性优于使用竞争者染色剂分离的RNA（图4）。在Agilent 2100生物分析仪上评估RNA完整性。如在电泳图中所见，在LCM染色试剂盒中用甲酚紫或吖啶橙染色的人肿瘤样品维持良好的28S/18S rRNA比率（图4）。使用LCM染色试剂盒与竞争对手的染色试剂盒染色样品后，大小分布也表明RNA降解较少。（图 4）。


图 4.使用Ambion的LCM染色提高RNA质量。从连续的组织切片中分离RNA，所述组织切片未染色或用三种不同染料（Ambion’s Cresyl Violet、Acridine Orange以及一种其他竞争者的染色剂）染色。RNAqueous Micro Kit（Ambion）用于处理用LCM染色试剂盒染色的样品。竞争对手的RNA分离试剂盒和染料用于处理单独的样品。在Agilent 2100生物分析仪上分析所有得到的RNA制备物。 （A）来自各种类型肿瘤样品的RNA制剂的28S/18S rRNA的比率。 （B）来自人结肠癌切片的RNA制备物的代表性Agilent bioanalyzer痕迹显示使用LCM染色和RNAqueous-Micro Kits（上图）分离的RNA与用竞争剂试剂（下图）分离的RNA相比较少降解。


来自用甲酚紫或吖啶橙染色的LCM样品的RNA可通过qRT-PCR或阵列分析来分析基因表达（图5）。RNAqueous-Micro Kit用于从图2中所示的LCM样品中分离RNA。通过qRT-PCR从该样品中扩增来自HPRT的RNA（图5A）。此外，RNAqueous-Micro Kit用于从图3中所示的LCM样品中分离RNA。使用 MessageAmpTM II aRNA扩增试剂盒（Cat＃1751）线性扩增该RNA（20ng）并用于随后的微阵列分析。Agilent bioanalyzer结果显示，在该实验中，aRNA的产量（平均值±SD，142±12µg）和大小分布（中值，1100nt）是优异的（图5B）。


图 5.来自LCM样品的qRT-PCR和aRNA扩增实验的代表性结果。（A）用用甲酚紫染色后从人卵巢LCM样品中分离的总RNA进行一步qRT-PCR反应以扩增HPRT mRNA（参见图2; LCM染色试剂盒，Ambion）。 （B）用吖啶橙（AO）（见图3）和甲酚紫（CV）（LCM染色试剂盒，Ambion）染色后，使用MessageAmp™II aRNA试剂盒（Ambion）扩增从小鼠海马和小脑中分离的20 ng总RNA。

LCM染色试剂盒组件

每个试剂盒都含有足以处理80个载玻片的试剂。试剂盒中包含了其他成分，可改善染色质量和显微切割。例如，该试剂盒配有一个障碍笔，用于将污渍定位在组织切片上; 提供脱水珠以促进组织脱水 - 这对于使用Arcturus仪器成功进行LCM至关重要; 无RNA酶的容器在加工过程中容纳载玻片; RNaseZap和 无核酸酶的水最大程度上减少组织样品暴露于环境RNase。还包括一张CD，它展示了组织切片、加工和染色方案中的几个关键步骤。用户只需提供ACS级乙醇、二甲苯和带样品的载玻片。

科学贡献者
Paul LeBourgeois、Ivonne Moon、Sharmili Moturi、Marianna Goldrick•Ambion公司。