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RNA 转染指南
RNA 转染是将 RNA 导入细胞的经典转染技术的分支。RNA 转染的目的与质粒转染相似。将 mRNA 导入细胞旨在表达编码蛋白以及研究基因功能和调控。siRNA 用于评估基因敲低影响的 RNAi 研究。这两种方法的一个主要区别是 RNA 只能进行瞬时转染。
RNAi 工作流程
下图描绘了 siRNA 设计和合成后的 RNAi 实验工作流程。在进行 RNAi 实验时，请确保您已具备：
- 转染/电穿孔的相应试剂和方案
- 用于评估敲低和其他 RNAi 效应的检测方法
- 阳性和阴性对照 siRNA
- 目标基因的两个或两个以上 siRNA
图1：siRNA 设计和合成后的 RNAi 工作流程
处理 RNA
RNA 寡核苷酸在处理过程中易于被引入的外源性核糖核酸酶降解。
- 处理 RNA 时请佩戴手套。
- 使用无核糖核酸酶的试剂、试管和屏障移液器吸头制备转染用 RNA。
- 应使用 70% 乙醇或其他核糖核酸酶去污液（如 RNaseZap RNase 去污液）擦拭工作区域。
转染效率
在哺乳动物细胞中转染 siRNA 的效率会因细胞类型和使用的转染试剂而异。这意味着应根据经验确定用于转染的最佳浓度。影响 siRNA 转染效率的主要变量如下：
- 转染试剂类型和数量
- 孔中铺板的细胞数量
- RNA 或 siRNA 类型
- RNA 或 siRNA 浓度
阳性对照
对于每项实验，纳入阳性对照很重要。阳性对照应在您研究所用的细胞和检测方法中引起可重现、易于测量的反应。如果观察到该对照的最大效应高于/低于预定阈值水平，即可确定同日其他实验的测量值具有可靠性。请注意，重要的是根据经验确定每项检测和每组成对对照的阈值。
对特定 RNA 或 siRNA 的反应程度与其转染效率直接相关。在评估转染效率方面，我们建议在每项实验中均纳入 BLOCK-iT 荧光寡核苷酸。在转染实验中使用 BLOCK-iT 荧光寡核苷酸，可通过任何荧光显微镜和标准 FITC 滤光片组轻松评估寡聚物的摄取和转染效率。高效率是指至少有 80% 的细胞摄取了荧光寡聚物。
阴性对照
为了获得有意义的数据，阴性对照与阳性对照同样重要。在实验中始终使用至少一个阴性对照设置一组等摩尔量转染，以便将靶标 RNA 或 siRNA 处理细胞的效应与对照处理细胞的效应相比较。来自这些关键对照的数据可作为评价实验靶标敲低的基线。
未转染细胞或仅转染阴性对照的细胞也非常有用。通过比较未转染培养物和转染非靶向阴性对照的培养物中管家基因的表达，可以获得转染对细胞活力影响的重要信息。
| 对照类型 | 推荐用途 | 推荐产品 |
|---|---|---|
| 转染对照 | 利用荧光计算并监测转染效率 |
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| 阴性对照 | 非特异性或乱序对照，用于测量相对于背景的敲低水平 |
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| 阳性对照 | 已知可实现高水平敲低的 RNAi 试剂，用于测量递送情况和优化实验条件 |
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| 未转染对照 | 测量正常基因表达水平和表型 | |
| 针对同一 RNAi 靶标的多个 RNAi 序列 | 用于验证表型变化、控制脱靶效应以生成符合出版物质量要求的结果 | |
| RNAi 滴定 | 使用最低有效水平，以避免改变正常细胞进程 | |
| 补救实验 | 关闭诱导型 RNAi 的表达，或引入表达靶标 mRNA 且不受 RNAi 序列影响的质粒 | BLOCK-iT Pol II miR RNAi 或 BLOCK-iT shRNA 载体，含诱导型启动子（分别为 CMV/TO 和 H1/TO） |
共转染
当用户需要同时将 siRNA 和表达某种蛋白的质粒引入细胞中时，可采用共转染法。该蛋白可以是试验系统的一部分，大多数情况下为报告基因（荧光素酶、GFP、β-内酰胺酶）。在某些情况下，用户可能想要在存在 siRNA 的同时表达一种突变蛋白，即利用 siRNA 阻断一个通路的同时，过表达一种突变蛋白。
当使用脂质体转染试剂时，质粒的存在可能会降低所有携带物（质粒和 siRNA）的转染效率，因此，转染优化非常重要。如果转染条件不佳，可能出现脂质体过多导致的非预期和非特异性细胞死亡，也可能出现敲低过少或质粒的蛋白表达过少。
siRNA 质量
siRNA 的质量可显著影响 RNAi 实验。siRNA 必须不含合成时残留的试剂，如乙醇、盐和蛋白质。此外，长于 30 bp 的 dsRNA 污染物据悉可通过激活非特异性干扰素应答和引起细胞毒性而改变基因表达（Stark 等人，1998）。因此，我们建议使用大于 80% 全长的标准纯度 siRNA。
将 siRNA 储存在 -20℃ 或 -80℃ 下，请勿储存于无霜冰箱中。我们的数据表明，多达50个冻融循环未对 100 μM siRNA 溶液产生不利影响（通过质谱法和分析 HPLC 进行评估）。然而，我们建议将重悬于无核糖核酸酶水或缓冲液中的 siRNA 以小等份分装储存，以避免可能的污染。
与单链 RNA 相比，退火的双链 siRNA 对核酸酶具有更高抗性。然而，在所有 RNAi 实验过程中都应该使用严格的无核糖核酸酶技术。
如果您怀疑 siRNA 制备物可能发生降解，请在非变性 15%-20% 丙烯酰胺凝胶中上样约 2.5 μg，进行电泳以检查 siRNA 的完整性。通过溴化乙锭染色使 RNA 显像，并验证其是否为预期大小和强度。siRNA 应作为一条紧密的条带迁移；如有弥散，则表示发生降解。
siRNA 数量
siRNA 的最佳量及其对基因的沉默能力在一定程度上受到靶基因产物特性的影响，包括 mRNA 定位、稳定性、丰度以及靶蛋白的稳定性和丰度。
尽管许多 siRNA 实验仍然使用 100 nM siRNA 转染细胞，但已发表的结果表明，使用更低浓度的 siRNA 进行转染可以降低 siRNA 的脱靶效应（Jackson 等人，2003；Semizarov 等人，2003）。对于脂质体介导的反向转染，10 nM 的 siRNA（范围 1-30 nM）
通常已足够。如果使用电穿孔递送 siRNA，则 siRNA 数量的影响不太明显，但通常 1 μg/50 µL 细胞 (1.5 μM) 的 siRNA（范围 0.5-2.5 μg/50 µL 细胞或 0.75-3.75 μM）已足够。
请记住，虽然过多的 siRNA 可能导致脱靶或细胞毒性作用，但过少的 siRNA 可能不会有效降低靶基因表达。由于涉及到如此多的变量，因此请务必针对所用的每个细胞系优化 siRNA 量。此外，非靶向阴性对照 siRNA 的量应与实验 siRNA 相同。
转染试剂体积
转染试剂的体积是关键优化参数，用量太少会限制转染，太多会导致毒性。整体转染效率受与 siRNA 复合的转染试剂用量的影响。为进行优化，在较宽的稀释范围内进行转染试剂滴定，并选择能够获得良好基因敲低的最大稀释浓度。对于每个细胞系，应根据经验确定这一关键体积。
细胞密度
虽然细胞密度对于需要提前铺板的传统转染实验很重要，但在通过反向转染递送 siRNA 的实验中，细胞密度不太关键，几乎不需要优化。然而，如果使用的细胞过多且 siRNA 的量没有按比例增加，则样本中的 siRNA 浓度可能太低，无法有效引发基因沉默。当细胞密度过低时，培养物可能变得不稳定。各孔的不稳定性可能存在差异，因为培养条件（例如，pH 值、温度）在多孔板中可能不均一，会对不稳定培养物产生不同的影响。
暴露于转染试剂/siRNA 复合物
尽管大多数转染试剂的设计原则是尽可能减小细胞毒性，但如果过量使用转染试剂或暴露时间过长，也可能对细胞培养物的整体健康产生不利影响。敏感细胞可能在暴露于转染试剂数小时后开始死亡。如果转染导致细胞过度死亡，应在 8-24 小时后去除转染混合物并补充新鲜的生长培养基。
转染期间存在血清
转染试剂与 siRNA 形成复合物应在减血清或无血清培养基中进行，从而避免血清成分干扰该反应。然而，形成复合物后，一些转染试剂可允许在含血清的正常生长培养基中进行转染（请遵循生产商的说明）。转染后通常不需要添加或替换培养基，但在某些情况下，即使使用的是血清相容试剂，改变培养基也可能有益。在使用特定试剂之前，请务必核实其血清相容性。一些转染试剂在转染过程中需要无血清培养基，并在与转染复合物初始孵育后更换为完全生长培养基。
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。