Dynabeads磁珠核酸纯化支持——问题排查

请查看以下情况，了解为什么 Dynabeads 磁珠不沉淀：

• 样品溶液粘度过高。
• 由于蛋白 - 蛋白相互作用，磁珠形成了聚集体。 

请尝试以下建议：

• 延长分离时间 (将管子放在磁力架上 2 – 5 分钟) 
• 裂解物中加入 DNase I (~0.01 mg/mL) 
• 将 Tween 20 浓度提高至结合和 / 或洗涤缓冲液的 ~0.05%。 
• 向结合缓冲液和 / 或洗涤缓冲液中加入多达 20 mM β - 巯基乙醇。

链霉亲和素分子与磁珠表面共价结合；在正常的推荐条件下，脱落可忽略不计 (37°C 下，链霉亲和素分子总量不到 0.2%)。然而，应该注意的是，并非所有的四个链霉亲和素亚单元都与磁珠是共价偶联的。通常，一个或两个亚单元共价偶联。链霉亲和素与其它蛋白类似，如果加热会变性并解聚为亚基。如果链霉亲和素偶联的 Dynabeads 磁珠被煮过，一些链霉亲和素亚基可能会从磁珠上释放出来（以单体或者聚合物形式）。共价偶联的链霉亲和素亚基不受这种处理的影响。当链霉亲和素与生物素偶联时，链霉亲和素—生物素复合物比单独的链霉亲和素更加稳定。

是的，您仍然可以使用它们。为了在实验室内测试低温下的稳定性，将 Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠在 -20 ℃下放置 24 小时，然后将其转移到室温 (15-25 ° C) 下72 小时。 此冻融循环重复 4 次，并将磁珠在 2-8 ° C 条件下储存 60 个月。然后检测了生物素结合能力，并发现其符合我们的质量标准要求。

链霉亲和素偶联的 Dynabeads 磁珠的结合能力具有片段长度依赖性。对大分子DNA 或 RNA 片段结合能力的下降可能是由于空间位阻所致。对于大分子 DNA 或 RNA 片段 (片段长度大于 2 kb) ，我们建议使用 Dynabeads kilobaseBINDER 试剂盒。以下是一些优化结合能力的建议。

• 盐浓度会影响生物素化核酸与 Dynabeads 链霉亲和素磁珠的结合效率。生物素化 DNA 片段 (长达 1 kb) 的较优结合条件是在1 M NaCl (最终浓度) ， 25°C 和 孵育15分钟下实现的。更长的 DNA 片段应固定过夜。生物素化抗体应在 pH 7.4 的PBS 缓冲液中固定，并添加 0.1% 的 BSA。 
• 请确保样品中没有过量的游离生物素，因为游离生物素会比较大的生物素化分子更快地结合 Dynabeads 链霉亲和素磁珠。生物素化寡核苷酸应通过反相 HPLC 或 FPLC 进行回收，以去除样品中的游离生物素。 
• 我们还建议根据每个特定应用的需要进行滴定实验，以优化使用的磁珠数量，因为特定分子的大小和生物素化过程都会影响磁珠的结合能力。

保持高 pH 值和低盐浓度，这将有助于保持核酸和磁珠上的负电荷。

背景可能是由于磁珠表面与 BSA 的非特异性结合所致。或者，高背景可能是由于与链霉亲和素的非特异性结合引起的。增加 pH 值或盐浓度可能有助于减少结合。Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠可能是一个更好的选择；这些磁珠没有包被 BSA ，且具有亲水性，因为其基于羧基化学原理。

Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠和 Dynabeads MyOne 链霉亲和素 C1 磁珠具有带负电荷的表面。磁珠的表面电荷可能会导致一些样品中的磁珠浮在液面上，或变得粘稠或聚集。粘性可能是由于磁珠之间或磁珠与管壁之间的静电相互作用造成的。通常，我们建议在进行实验之前，用诸如 Tween 20 去污剂的非离子去污剂洗涤磁珠。通常只需将 Tween 20 去污剂加入到磁珠中，最终浓度可达到0.1%，然后在不含去污剂的缓冲液中重悬并洗涤磁珠，就可以减少或消除这个问题。可能需要在 Tween 20 溶液中孵育，例如在室温下滚动孵育 5-10 分钟。此外，我们建议使用硅化管。这种处理很可能降低磁珠的静电电势。

不建议，因为链霉亲和素在变性过程中会成为疏水性和聚集体。

通过从洗脱液中重新提取 mRNA ，有效地去除核糖体 RNA。重复使用与原始分离的相同 Dynabeads Oligo (dT) 25 磁珠。在洗涤缓冲液 B 中洗涤磁珠两次。 用裂解 / 结合缓冲液的4倍体积稀释洗脱的 mRNA ，然后加入磁珠。在室温下孵育 3-5 分钟，然后继续执行 mRNA 直接分离方案。

出现 DNA 污染的原因如下：

• DNA 剪切不完整。 
• 杂交步骤后未完全去除样品裂解物。 
• 洗涤不充分和/或未完全去除洗涤缓冲液。 
• 样品与磁珠的比率过高。

抑制剂可能会抑制 PCR ，或者可能使用的 PCR 循环次数不足。对于抑制剂，请确保将洗涤缓冲液恢复至室温后使用，并更加有力地加入缓冲液。您还可以确保在每个洗涤步骤中完全去除上清液，或引入额外的洗涤步骤。

我们建议使用重悬缓冲液、水或低离子强度缓冲液，在 65°C 下孵育>5分钟来洗脱 DNA。必须在洗脱前完全重悬复合物。洗脱缓冲液可预热至 65° C。 孵育后，将管子放入磁力架中30秒，然后将上清液转移到干净的管子中。为了确定洗脱效率，您可以将一部分洗脱的DNA在琼脂糖凝胶上进行电泳分析。或者，您可以选择使用 Dynabeads 进行 PCR ，以确定 Dynabeads 上是否残留有 DNA。使用更多预热洗脱缓冲液可能有助于提高洗脱效率。

高 PCR 背景可能是由于模板 DNA、引物、 Mg2+ 或 dNTP 浓度过高引起的。为了解决这个问题，减少模板 DNA 、引物、酶和 Mg2+ 的使用量，在 PCR 扩增之前洗脱 DNA，和/或尝试进行热启动 PCR。高背景也可能是由污染引起的。 确保在每个洗涤步骤中完全去除上清液，以避免残留物的带入。

我们建议检查白细胞计数和 / 或提高样品的质量和数量。

您可以尝试移液较长的时间，或将管子快速移动到一个不平整的表面上，例如铁螺纹试管架，以实现振荡的效果。您也可以尝试使用小孔径的移液枪头。

以下是您可以尝试的一些建议：

• 如果在洗涤步骤中观察到复合物断裂，请减少加入洗涤缓冲液时的力度。 
• 洗脱步骤可能不够有效。请确保在添加重悬缓冲液之前，彻底去除所有洗涤缓冲液。 在重悬步骤中增加混合复合物的力度。 
• 提高样品的质量和数量。

以下是您可以尝试的一些建议：

• 可能是红细胞裂解不完全导致的；请增加孵育时间或重复红细胞裂解步骤。 
• 更用力地加入洗涤缓冲液。 
• 确保在每个洗涤步骤中完全去除上清液。 
• 对 PCR 使用较少的起始材料。

变黄的最大原因是在使用裂解/结合缓冲液制备洗涤缓冲液 1 时加入了异丙醇。使用质量较差的异丙醇 (非分子级) 会导致迅速变黄。高质量的醇类不会引起这种情况。