cDNA文库和cDNA文库构建 - 入门

我们建议使用CloneMiner™ II cDNA文库构建试剂盒（货号A11180），无需使用限制性内切酶克隆，即可构建高质量的与Gateway克隆兼容的cDNA文库。该系统使用了高效重组克隆技术，与使用标准cDNA文库构建方法相比，可获得更多的原代克隆。

第一链cDNA合成最常采用的引物是oligo(dT)或者对其进行修饰之后得到的序列（比如引物-接头），它们会结合到mRNA的poly(A)尾端。这种启动方法有两大优势：仅复制含有poly(A)的 RNA；大部分cDNA克隆在mRNA的3’端开始。

当然，oligo(dT)启动也有一些局限性——一些cDNA克隆可能不是全长的（因为RNA二级结构或逆转录酶中止），而且不含poly(A)的 mRNA不能被复制。

另一种方法是使用随机六聚体引物，理论上，该引物可以结合和启动几乎所有RNA模板。随机六聚体引物单独使用或与oligo(dT)结合使用获得的cDNA，比单独使用oligo(dT)启动所得的cDNA包含更多的5’信息。此外，随机六聚体引物可用于以不含poly(A)的 mRNA和单链病毒RNA为模板生成cDNA文库。

Gateway入门克隆cDNA文库可转入到合适的目标载体中用于基因表达。您无需担心在克隆前对cDNA或载体进行限制性酶切（对cDNA的酶切会减小插入片段的大小）。

CloneMiner™ II试剂盒具有以下改进之处：

• 使用SuperScript III RT代替了SuperScript II RT
• 使用BP Clonase II酶混合物代替了BP Clonase酶混合物
• 对cDNA片段化分离方案进行了简化，无需对cDNA以及收集的3个部分进行放射性标记

不建议这样做。pDONR™ 222的kan基因在相反的方向。经验发现，这能够增加转化效率，从而可能达到最高的初始滴度。

不能，pDONR™ 222载体不能作为单独载体购买。但是，该载体可在OneShot ccdB Survival™ 2 T1R细胞中扩增。扩增后，一定要确认ccdB基因没有在扩增过程中丢失。将扩增得到的pDONR™ 222转入ccdB Survival™ 2 T1R细胞和TOP10细胞（或其他敏感菌株）后，对两种细胞产生的菌落数量进行比较。转入ccdB Survival™ 2 T1R细胞时，得到的细胞数量会多出10,000多倍。

我们不建议使用化学感受态细胞。如果使用化学感受态细胞，则原代克隆的数量会降低多达100倍。

有必要，我们强烈建议沉淀DNA以避免BP Clonase II反应产物用电感受态细胞转化时产生电弧。可用水代替TE重悬沉淀DNA。

推荐使用CloneMiner™ II cDNA文库构建试剂盒构建纳克级文库。可使用低至50 ng的小量mRNA构建含105-106个原代克隆的纳克级文库。

SuperScript全长cDNA文库构建试剂盒已停产。替代品为CloneMiner™ II cDNA文库构建试剂盒，货号A11180。

Gene Pool™ cDNA是采用M-MLV在42°C下进行逆转录制备得到的。

生成全长cDNA的关键是以高质量的完整RNA作为起始材料，并使用最高质量的试剂进行逆转录。所有用于合成Gene Pool™ cDNA的RNA都是采用预先检测过的试剂进行纯化的。纯化后，使用DNase处理RNA以除去DNA污染，DNA污染可在PCR中产生伪条带。用紫外分光光度法进一步分析cDNA的纯度。为了保证逆转录的质量，通过扩增actin和clathrin管家基因的片段对每个反应进行验证。长6 kb的 clathrin转录本的5’末端必须被有效扩增，从而满足我们严格的质量标准。PCR扩增6 kb基因5’末端的能力可以证明逆转录反应的完整性和持续性，从而确保生成全长cDNA。

可以，Gateway LR反应使您能够将利用Gateway入门载体制备的cDNA文库转入Gateway目的载体中，并且对文库的平均插入片段大小或插入片段大小范围无显著影响。因此，在LR反应后，文库的复杂度得以保留。文库转移反应实验方案详见CloneMiner™ II cDNA文库构建试剂盒使用手册。

没有能够维持原始文库复杂度的方法可以推荐。最好的方法是使用CloneMiner™ II cDNA文库构建试剂盒构建一个新的文库。该试剂盒可利用BP反应将所有生成的cDNA克隆到Gateway兼容的载体中。

这取决于lambda载体是否具有与我们系统设计兼容的重组（att）位点。无att位点的文库，肯定不是Gateway兼容的。

可以，但是pCMVSport载体没有真核复制起点或筛选标记物，因此，您只能对瞬时表达进行筛选。

这取决于文库。只有用pCMVSport6或pCMVSport6.1载体构建的文库才具有attB序列。

cDNA插入片段是克隆在pCMVSport载体的Not I/Sal I位点中的。Sal I位点是正义链的5’末端。因此，如果要从正义链生成体外转录/翻译产物，需要使用SP6启动子。

克隆到慢病毒载体中的插入片段不应具有poly(A)信号。在cDNA合成过程中使用oligo(dT)，会使固有的poly(A)信号（AATAAA或与之相似的）被扩增，并随后成为cDNA文库或其克隆的一部分。

由于慢病毒是一种RNA病毒，在合成用于包装的RNA基因组时，如果插入片段中有聚腺苷酸化[poly(A)]信号，则会过早终止RNA。几乎所有来自Gateway cDNA文库的克隆都有一个poly(A)信号，若将其插入慢病毒载体中，最终会过早终止病毒RNA。

为避免过早终止慢病毒RNA，请考虑以下建议：

应首先从文库中分离目的基因，克隆到无poly(A)信号（即，从ATG到终止子）的入门载体中，如pENTR™/D-TOPO，然后再转入慢病毒载体。

如果你在尝试建立一个慢病毒表达文库，你可能不得不采用一个使用随机六聚体引物而不是oligo(dT)进行扩增的文库，因为这种文库的插入片段含有poly(A)信号的可能性更小。

插入片段大小通常不是问题。慢病毒的插入片段大小极限约为5–6 kb（SuperScript II预制文库的平均插入片段大小约为1.5 kb）。

对原代cDNA转化子进行半固体扩增，可将质粒cDNA文库扩增过程中可能出现的代表性的偏好性降至最低。我们也推荐在30°C下进行扩增，这将有助于使不稳定的克隆变稳定。以下为详细的实验方案。

注意：装有含悬浮克隆的半固体琼脂的培养瓶，必须轻柔处理并要静止培养。粗鲁操作或碰撞培养箱会使小菌落离开溶液。有风扇的培养箱也能导致菌落离开溶液。

推荐步骤：

1. 制备2.0 L的2X LB。取出200 mL的2X LB，用于制备2X LB甘油培养基（见下文）。
2. 准备4个可耐受高温高压消毒的500 mL瓶子，向每个瓶子中放入1个大搅拌子和1.35 g SeaPrep（FMC）琼脂糖。将瓶子置于搅拌盘上。启动搅拌盘，向每个瓶子中加入450 mL的2X LB（避免形成较大的琼脂糖块）。
3. 将这些装有2X LB琼脂糖的瓶子高压灭菌30分钟。
4. 将瓶子在37°C水浴中冷却2小时左右，直到培养基达到37°C。
5. 培养基温度降到37°C后，加入适量的筛选用的抗生素。对于氨苄青霉素抗性基因，加入50 µg/mL羧苄青霉素（首选）或200 µg/mL氨苄青霉素，在搅拌盘上混合。（羧苄青霉素可减少卫星菌落的形成。）
6. 向每个瓶子中加入4 x 105–6 x 105原代cDNA转化子（来自原始文库的克隆），然后在搅拌盘上充分混合2分钟。拧紧盖子。
7. 将瓶子放在冰浴（0°C）中，使水浴锅中的水位与瓶子中培养基的上水平线对齐。在冰浴中孵育1小时。
8. 轻轻将瓶子从冰浴中取出，擦去瓶子外面的水，松开瓶盖。将这些瓶子放在30°C重力流培养器中。
9. 将这些瓶子置于无干扰条件下培养40–45小时。在收菌当天的早晨，将Sorvall GSA转子置于室温下。
10. 将瓶子的内容物倒入Sorvall GSA瓶子中，在室温下以8,000 rpm离心20分钟（注意：应确保在放入Sorvall GSA瓶子前，转子已在室温下放置至少2小时。4°C的转子会导致琼脂凝固）。
11. 倒出上清液。
12. 将细胞重悬于总体积为100 mL的2X LB甘油（12.5%）中。取出2份100 µL溶液，用于涂布、进一步分析和估测克隆数。如果有琼脂糖块，可以通过无菌纱布过滤去除。
13. 将细胞分装成每份10 mL左右（注意：分装一些1 mL和100 µL体积会有用处），并放在-70°C。保存于-70°C。

冻存的细胞可进一步在30°C液体中进行扩增，以获得DNA。每100 mL培养基使用2.5 x 109个细胞，用于对文库进行进一步扩增。

2 X LB配方：
20 g 胰蛋白胨
10 g 酵母提取物
10 g NaCl
加水溶解至1,000 mL

2 X LB 甘油（12.5%）配方：
175 mL 2 X LB
25 mL甘油（100%）
过滤除菌，可在室温下保存长达2个月。

参考文献：
Kriegler M (1990) Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual. Stockton Press, New York, NY.
Hanahan D, Jessee J, and Bloom FR (1991) Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods Enzymol 204:63-113.