用于原位细胞凋亡检测的 Click-iT™ Plus TUNEL 检测试剂盒

•当铜离子在合适的化合价时，点击反应才有效。除了DIBO炔烃-叠氮化物反应外，在缺乏铜离子的条件下，叠氮化物和炔烃不会相互反应。确保在制备之后、二价铜(II)浓度最高时，立即使用点击反应混合物。
•不要使用已经变黄的添加剂缓冲液；其必须无色状态下才有活性。
•为确保TdT酶和点击反应试剂能够到达核内，细胞需要充分地固定和通透。为确保有足量的TdT能进入，组织样品需要用蛋白酶K或其他蛋白水解酶消化。
•部分试剂能结合到铜离子上，并减少其足以催化点击反应的有效浓度。click反应前，不要在任何缓冲液或试剂中引入任何金属螯合剂（例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐等）。避免缓冲液和试剂中引入其他可能被氧化或还原的金属离子。进行click反应前，可能需要向细胞或组织样品加入额外的洗涤步骤。
•您可以用新鲜的试剂再次进行点击反应，从而提高信号。将点击反应的时间延长至超过30分钟，并不会提高信号。用新鲜的点击反应试剂再次进行30分钟的孵育，可更有效地提高标记效率。
•自己的细胞可能没有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应和点击标记反应是否正确进行。

click反应在叠氮化物和炔烃类间极具选择性。生物体系不可能有其他副反应。任何非特异性背景都是由于染料和多种细胞内组分的非共价连接。Select FX信号增强剂在click反应后减少染料的电荷为基础的非特异性连接方面效果不明显；我们不推荐将其与Click-iT检测试剂一同使用。最佳的减少背景的方法是增加BSA清洗的次数。你应该在同样的过程和检测条件下做无染料或无click反应对照，以证实背景确实是由于染料而不是自发荧光。你同时应该在无TdT酶的对照样品进行完整的click反应来证实click反应信号的特异性。 

click反应中的铜离子使得DNA少量变性（虽然没有BrdU检测所需要的程度），这会影响到包括DAPI和Hoechst染色剂在内的DNA染料的结合亲和力。这种影响只会在传统的EdU试剂盒中出现，而Click-iT Plus EdU试剂盒由于采用的铜离子浓度低，不会出现这种现象。 

可以，额外的末端脱氧核苷酸转移酶（rTdT）可以购买。货号为10533-065或10533-075。额外的TdT反应缓冲液可以购买，货号为16314-015。

我们没有在3D培养体系中使用过EdU TUNEL检测调亡，但是因为这种试剂适用于体内细胞标记，所以它也有希望可以标记3D培养体系中的细胞。文献中有大量关于在3D培养体系中使用这种产品报道；此处有一些引证：

Lei Y, Schaffer DV (2013) A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.Proc Natl Acad Sci U S A 110:E5039–E5048.
Derda R, Laromaine A, Mammoto A et al.(2009) Paper-supported 3D cell culture for tissue-based bioassays.Proc Natl Acad Sci U S A 106:18457–18462.
Robertson FM, Ogasawara MA, Ye Z et al.(2010) Imaging and Analysis of 3D Tumor Spheroids Enriched for a Cancer Stem Cell Phenotype.J Biomol Screen 15:820–829.